老年患者分离肺炎克雷伯菌常见高毒力血清型及blaKPC耐药基因的调查与分析

赵燕，张婷，史继敏，李刚

1 复旦大学附属金山医院检验科，上海201508；2 复旦大学附属金山医院临床研究中心，上海201508

肺炎克雷伯菌是一类革兰阴性杆菌，动力阴性，能发酵乳糖，广泛存在于各种环境中，是医院获得性感染常见病原菌之一[1]。肺炎克雷伯菌分为高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella Pneumoniae，hvKP）和经典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella Pneumonia，cKP）。hvKP 可引起社区获得性肝脓肿，且常常继发远距离播散引起脑脓肿、肺部感染、眼部感染等，死亡率高。hvKP 最重要的毒力因子是荚膜多糖，与hvKP 关联的荚膜多糖血清型有K1、K2、K5、K54、K57 等[2-5]。cKP 常引起医院获得性感染，其对碳青霉烯耐药率逐年升高，携带blaKPC 是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯最常见的原因[6]。明确携带的耐药基因对临床治疗药物的选择有重要的指导作用。近年来hvKP和cKP 有逐步融合进化的趋势，一方面hvKP 通过水平转移的机制获得耐药基因，呈现出高耐药高毒力的特征[7-8]；另一方面cKP 获得毒性质粒呈现出高耐药高毒力的特征[9]。这些细菌都呈现出高毒力高耐药的特征，感染后患者治疗选择有限，预后差。因而本研究收集上海某三级综合医院2018年10月—2018年12月老年患者非重复分离的肺炎克雷伯菌58 株，利用多重PCR 法检测老年患者感染肺炎克雷伯菌的血清型、毒性质粒携带的rmpA2 基因及blaKPC 耐药基因，为临床治疗、感染控制提供支持。

1 材料方法

1.1 菌株6 株阳性对照菌株为本实验室前期已完成基因组测序肺炎克雷伯菌，分别为ST23 克隆K1 血清型、ST1049 克隆K5 血清型、ST29 克隆K54 血清型、ST592 克隆K57 血清型、ST65 克隆K2 血清型携带blaKPC 耐药基因、ST11 克隆K64 血清型携带blaKPC耐药基因及pLVPK 样毒性质粒，临床菌株为2018年10月—2018年12月老年患者非重复分离的肺炎克雷伯菌58 株。

1.2 试剂及仪器多重 PCR 试剂盒（Thermo fisher 公司）,DNA 抽提试剂（生工生物工程上海股份有限公司），PCR 扩增试剂、扩增仪（宝日医生物技术(北京) 有限公司）、电泳仪器及成像系统（美国Bio-Rad公司）、引物由苏州金维智生物有限公司合成（见表1）。抗菌药物包括阿米卡星、庆大霉素、氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑、头孢吡肟、环丙沙星、美罗培南、哌拉西林一他唑巴坦、舒巴坦、替加环素、多黏菌素B 购自英国OXOID 公司。

1.3 细菌鉴定及药物敏感试验 所有细菌均采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定，KB 法检测药物敏感性试验，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.4 药物拉丝试验 临床分离肺炎克雷伯菌种接种到哥伦比亚血琼脂培养基，置于37°C 培养箱中过夜培养。次日用接种环挑起一个菌落并轻轻向上拉起，如果拉出的粘液丝长度超过5 mm 时，判断为拉丝试验阳性，否则为拉丝试验阴性。

1.5 基因组DNA 提取 将-80℃冻存的肺炎克雷伯菌临床分离株转种于血平板上，置于孵箱37℃过夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB 液体培养基中，37℃恒温摇床200 转/min 过夜培养，取1 mL 菌液用磁珠法细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，-20℃冻存备用。

1.6 多重PCR及电泳根据生物信息学及文献分析的基础上，针对临床分离率较高的前5 种血清型、rmpA2基因、及blaKPC 耐药基因设计引物，建立多重PCR同时检测老年患者感染肺炎克雷伯菌的血清型、毒性质粒携带的rmpA2 基因及BlaKPC 耐药基因。先将引物稀释至100mol/L 待用，再稀释至每条引物终浓度稀释至0.1mol/L，PCR 扩增条件为95℃预变性2 min；95℃变性30 秒，60℃退火90 秒，72℃延伸40 秒，30 个循环后再延伸5min。产物经3%琼脂糖凝胶电泳，Gelred 荧光染料染色，凝胶成像系统下观察结果。

表1 引物序列

2 结果

2.1 药物敏感试验结果 以2017 版CLSI 为判断标准，58 株肺炎克雷伯菌中对头孢噻肟或头孢他啶耐药20株，占比34.5%；亚胺培南和美罗培南耐药15 株，占比25.9%。未检出替加环素及多黏菌素耐药菌株，所有碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌均携带blaKPC 基因。

2.2 拉丝试验结果58 株肺炎克雷伯菌中拉丝试验阳性共25 株，占43.1%，拉丝试验阴性33 株，占56.9%。

2.3 多重PCR结果以本实验室前期已完成基因组测序的ST23 克隆K1 血清型、ST1049 克隆K5 血清型、ST29 克隆K54 血清型、ST592 克隆K57 血清型、ST65克隆K2 血清型携带BlaKPC 耐药基因、ST11 克隆K64 血清型携带BlaKPC 耐药基因及pLVPK 样毒性质粒为参考菌株来优化多重PCR 体系。结果见图1，所有目标基因扩增条带均清晰可见。58 株临床菌株中，以携带rmpA2 为判断标准共检出24 株hvKP（41.4%），其中K1 血清型hvKP7 株（12.1%）、K2 血清型hvKP4 株（6.9%）、K5 血清型hvKP2 株（3.4%）、K54 血清型hvKP2 株（3.4%），单独携带rmpA2 基因血清型未知hvKP2 株（3.4%），同时携带rmpA2 及BlaKPC 基因肺炎克雷伯菌7 株（12.1%）。见图2及表2。

3 讨论

本研究中58 株肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南耐药的耐药率为25.9%，而同期CHINET 监测网亚胺培南耐药率为26.1%（http: //chinets.com/），与本研究基本一致。肺炎克雷伯菌耐药物机制主要有产生各种水解酶、外膜蛋白缺失致渗透性降低、外排泵高表达、靶位点改变等[10]。本研究中15 株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌均携带blaKPC 耐药基因，说明携带blaKPC 耐药基因是本研究所收集碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的主要耐药机制。blaKPC 耐药基因通常位于质粒上，通过质粒的水平转移在不同细菌种属间广泛播散，尤其是在炎克雷伯菌中blaKPC 检出率最高，给临床治疗带来极大困难[11]。

58 株肺炎克雷伯菌中拉丝试验阳性共26 株，占44.8%，高粘液表型是hvKP 显著特征，因而拉丝试验被发展用来检测hvKP，然而近年来研究报道部分低毒力ST11 型肺炎克雷伯菌呈现高粘液表型，有学者提出高粘液和高毒力是两种不同的表型[12-13]，限制了拉丝试验在临床的广泛使用。在25 株拉丝试验阳性肺炎克雷伯菌中15 株为常见的高毒力血清型，另外9 株rmpA2 阳性血清型未知的菌株。rmpA2 编码荚膜多糖调节因子，位于pLVPK样毒性质粒上，pLVPK样毒性质粒通常在170kb 至220kb 大小，是hvKP 的标志之一，几乎存在于所有的hvKP 中，目前只有台湾曾报道肺炎克雷伯菌1084 不含有此类质粒[14]。香港Yang 等报道毒性质粒可通过接合方式自主转移，从而增加经典肺炎克雷伯菌荚膜多糖的产量，提高肺炎克雷伯菌在小鼠及大蜡螟模型上的致病性[15]。浙江大学Gu D 等报道碳青霉烯耐药的cKP 中发现了pLVPK 样毒性质粒，呈现出粘液样表型，5 例年龄53～73 感染的病人全部死亡[9]。本研究中携带rmpA2 血清型未知的高毒力肺炎克雷伯菌9 株，其中携带blaKPC 耐药基因的高毒力碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌7株，碳青霉烯耐药的hvKP 已在住院老年患者中流行。

综上所述，本研究中老年患者分离的肺炎克雷伯菌中碳氢霉烯药物耐药率有较高的检出率，携带bla-KPC 耐药基因是耐药的主要原因；高毒力肺炎克雷伯菌的比例高达41.4%。老年患者身体机能退化、免疫功能降低，且易患糖尿病、高血压、肾功能损伤等各种基础疾病，因此老年住院患者更易发生医院获得性感染。老年患者感染后发病不典型，早期诊断难度大，容易并发多器官损伤甚至功能衰竭，治疗预后差。因而医院应加强对老年患者感染高毒力肺炎克雷类伯菌及碳氢霉烯耐药肺炎克雷类伯菌的监测，减少感染发生。