miR-543调控乳腺癌细胞增殖和侵袭的机制分析

许前进 杨景峰 国 擎

乳腺癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，该病多见于中成年女性。随着检测技术的提高，乳腺癌在我国呈现发病率增高及年轻化的趋势[1]。手术为该病的首选治疗方法，但是中晚期乳腺癌的临床预后比较差，基本失去了手术指征，导致5年生存率低[2-3]。因此进一步研究乳腺癌的发病机制，寻找治疗乳腺癌新的治疗靶点具有重要价值。现代研究表明肿瘤的发生与发展是1个复杂的分子调控失控过程，涉及到细胞信号传导异常、细胞基质间黏附障碍、癌基因激活、抑癌基因失活等[4-5]。miRNAs是1组内源性小的非编码RNA，广泛存在于真核生物中，可通过转录后抑制基因表达或通过结合特定目标基因的3’末端非翻译区域来发挥癌基因或抑癌基因的作用[6]。当前也有研究表明，miRNAs表达在肿瘤发生和发展中发挥重要的作用[7]。miR-543作为miRNAs家族的一员，在结肠癌、胶质瘤中表达上调发挥致癌基因作用[8-9]。乳腺癌组织miR-543的表达较正常子宫内膜组织明显降低，可发挥抑癌基因作用[10]，但是具体的作用机制还不明确。B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，Bmi-1)属于多梳基因单位，可直接调节细胞生长、增殖，也可通过调控染色质结构的变化来调节基因活性[11]。具体探讨了miR-543对乳腺癌细胞的增殖和侵袭的影响，并明确了其作用机制，希望为乳腺癌的靶向治疗提供新的方向。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)购自于上海中科院细胞库，0.25%胰蛋白酶Invitrogen公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Sciencell公司，miR-543 mimics与mimics NC购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 细胞分组与转染

MDA-MB-468细胞与Hela细胞均采用RPMI-1640培养基，添加10%胎牛血清，含100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml链霉素的混合液进行培养，培养条件：37 ℃、5% CO2培养箱，每1～2天传代一次。取对数生长期的MDA-MB-468细胞分为三组-对照组、miR-543组与空白组。对照组、miR-543组分别转染mimics NC与miR-543 mimics，转染浓度为50 nM；空白组以等体积的磷酸盐缓冲液进行转染。转染前24 h，将处于对数生长期的细胞接种于6孔培养板。用250 μl RPMI1640培养基稀释5 μl转染试剂Lipo-2000，室温下静置5 min。然后用25 μl RPMI1640培养基稀释5 μl mimics NC与miR-543 mimics，孵育5 min进行混匀，形成复合物，滴入RPMI1640培养基中，转染后6 h换液1次，然后进行常规培养。

1.3 MTT法检测细胞增殖指数

MDA-MB-468细胞接种密度为3×105细胞/孔，接种于无菌的96孔板中，转染后继续培养，然后每孔加入20 μl MTT试剂(5 mg/ml)，继续培养4 h，弃去上清培养基，加入200 μl的DMSO，避光振荡溶解10 min，采用测定吸光度值。细胞增殖指数=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集1.3中转染后的细胞，继续进行常规培养，采用凋亡试剂盒(Annexin-V/PI)进行避光染色1 h，采用流式细胞仪检测细胞凋亡指数。

1.5 Transwell小室检测细胞转移与侵袭

收集1.3中转染后的细胞，继续培养后进行消化，按1×105细胞/孔接种在小室的上室中，体积为200 μl。Transwell小室下室加入750 μl含20%胎牛血清的RPIM 1640培养基，继续培养24 h。取出Tranawell小室，弃去小室液体，清洗2次后将小室置于甲醛溶液中固定15 min，再次洗涤后将小室放入0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下观察拍照，计算细胞转移。在侵袭实验中，实验前1天将-20 ℃冻存的基质胶置于室温下溶解，Transwell小室经消毒后放置在无菌24孔板中，小室内加入基质胶100 μl，常规进行培养，后续处理同细胞转移实验，计算细胞侵袭指数。

1.6 qRT-PCR检测mRNA表达水平

收集1.3中转染后的细胞，加入Trizol后提取细胞总RNA，采用Real-time quantitative PCR检测miR-543表达水平，以U6作为内对照组，在ABI 7500荧光定量PCR仪上，PCR反应条件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环，计算miR-543相对表达水平。

1.7 Western Blotting检测蛋白表达水平

收集1.3中转染后的细胞，提取细胞总蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜后采用Western Blotting法检测Bmi-1表达水平，以β-actin作为内对照组，采用ImageJ软件测量蛋白灰度值并分析各组细胞目的蛋白相对表达量。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 miR-543相对表达水平对比

转染后24 h与36 h，miR-543组miR-543相对表达水平显著高于空白组与对照组(P<0.05)，空白组与对照组对比无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 细胞增殖指数与凋亡指数对比

转染后24 h与36 h，miR-543组的细胞增殖指数显著低于空白组与对照组(P<0.05)，细胞凋亡指数显著高于空白组与对照组(P<0.05)，空白组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 三组转染后不同时间点的miR-543相对表达水平对比

表2 三组转染后不同时间点细胞增殖指数与凋亡指数对比

2.3 细胞转移与侵袭指数对比

转染后24 h与36 h，miR-543组的细胞转移与侵袭指数都显著低于空白组与对照组(P<0.05)，空白组与对照组对比无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 三组转染后不同时间点细胞转移与侵袭指数对比

2.4 Bmi-1蛋白相对表达水平

转染后24 h与36 h，miR-543组的Bmi-1蛋白相对表达水平显著低于空白组与对照组(P<0.05)，空白组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 三组转染后不同时间点Bmi-1蛋白相对表达水平

3 讨论

近年来乳腺癌的发病率逐年增高，多数患者可在早期诊断，预后较好，5年生存率在80%以上。然而晚期与复发性乳腺癌的预后则比较差，5年生存率约为20%[12]。根治性手术是早期乳腺癌的1种有效治疗方法，但是也有30%左右患者在术后可发生转移，为此早期发现乳腺癌增殖和侵袭的分子和信号通路具有重要价值[13-14]。

miRNAs是1种非编码小RNA，通过抑制靶基因的表达，进而调节肿瘤细胞的生物学行为[15]。有研究显示控制乳腺癌发生的miRNAs靶基因能调节乳腺癌的早期发展，且与肿瘤组织的血管生成、细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖和侵袭等明显相关[16-17]。miR-543位于染色质19q13.42上，在乳腺癌、T细胞淋巴瘤、食管癌等组织中呈现异常表达情况，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[18-19]。本研究显示转染后24 h与36 h，miR-543组的细胞增殖指数、细胞转移与侵袭指数显著低于空白组与对照组，细胞凋亡指数显著高于空白组与对照组，空白组与对照组对比差异无统计学意义，表明miR-543的过表达能抑制细胞增殖、转移与侵袭，促进细胞凋亡。而转移与侵袭是乳腺癌预后不良的主要因素，也表明miR-543可为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的靶标[20]。

肿瘤细胞的增殖和侵袭是恶性肿瘤的主要标志及体现，子宫基底层的侵袭程度是乳腺癌预后的主要因素之一，也是肿瘤患者发生癌变的主要因素之一[21]。miRNAs是约由22个核苷酸组成的短链非编码RNAs，通过与靶向基因的mRNA序列互补结合来影响多种生物过程。既往研究发现miRNAs在子宫内膜分泌期、增殖期、月经期以及乳腺癌的发展过程中都可参与调控细胞的增生[22]。已有研究发现miR-543家族有抑癌作用，包括调节细胞分裂和凋亡、逆转化疗、抑制肿瘤干细胞的自我更新和分化等[23]。特别是miR-543能通过上调PTEN基因的表达，促进乳腺癌细胞的增殖、转移及侵袭，miR-543也能经PETN-PI3K/AKT等信号通路在胃癌中抑制细胞增殖。miR-543在乳腺癌细胞中呈现低表达，上调miR-543 表达可显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡[24]。

早期研究显示miRNAs可通过靶向转录因子Bmi-1实现对恶性肿瘤细胞增殖及凋亡的调控[25-26]，但是在乳腺癌细胞中的作用还不明确。本研究显示转染后24 h与36 h，miR-543组的Bmi-1蛋白相对表达水平显著低于空白组与对照组，空白组与对照组对比差异无统计学意义，表明随着miR-543 表达的上调，Bmi-1蛋白表达水平明显降低，提示miR-543在乳腺癌细胞对Bmi-1 蛋白表达具有一定调控作用。不过miR-543 是否还可通过调控其他下游基因发挥作用仍有待进一步研究证实。

总之，miR-543在乳腺癌细胞中可抑制Bmi-1基因的表达，促进细胞凋亡，发挥抑制细胞增殖和侵袭的作用。