宫颈癌组织中miRNA-21表达与其发展及预后的关系

张小燕 黄 娟 李晓丽

宫颈癌在高危型HPV病毒感染的人群中，具有较高发病率。在不同的内外环境诱导下，宫颈柱状上皮细胞的异常增殖，能够显著促进宫颈癌的发生和宫颈癌患者临床预后的恶化[1]。在细胞代谢分子作用水平，可以发现肿瘤相关调控基因的异常改变，能够在宫颈癌细胞的增殖、转录调控、癌细胞分化等方面发挥作用[2]。微小RNA-21(miRNA-21)是微小RNA家族相关成员，其能够通过促进癌细胞的增殖，加速肿瘤细胞核DNA的分裂，调控上皮细胞的上皮-间质转换过程，进而参与到宫颈上皮细胞的病变过程[3]。有部分研究者探讨了其他微小RNA家族相关因子的表达与宫颈癌的关系，认为在宫颈癌患者病灶组织中，存在显著的微小RNA的表达波动[4]，但对于miRNA-21的分析不足。本次研究选取收集的87例经病理学检查确诊的宫颈癌组织标本，探讨了miRNA-21的表达与宫颈癌患者临床病理特征及临床预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2015年1月至2016年10月收集的87例经病理学检查确诊的宫颈癌组织标本(宫颈癌组)、同期在我院行宫颈检查确诊为宫颈炎的组织标本90例(对照组)。

宫颈癌组，患者年龄40～68岁，平均(57.3±7.4)岁，国际妇产联盟分期(FIGO)：Ⅰ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期27例、Ⅳ期5例；肿瘤分化程度：高分化29例、中分化33例、低分化25例；淋巴结转移阳性38例；肌层浸润深度≥1/2 41例、肌层浸润深度<1/2 46例；肿瘤病灶：≥3.0 cm 47例、<3.0 cm 40例。对照组，患者年龄42～65岁，平均(56.0±9.1)岁。2组患者的年龄比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)。

入选标准：①宫颈癌的诊断标准参考中华医学会制定的标准[5]；②术前经病理学活检证实，术后经病理学检查证实；③患者无放化疗、免疫学治疗病史；④本研究符合《赫尔透辛基宣言》相关医学伦理规定。

排除标准：①伴有其他部位的恶性肿瘤；②手术后复发的宫颈癌患者；③甲状腺功能障碍患者；④合并宫颈、生殖系统其他重大疾病的宫颈癌患者。

1.2 实时荧光定量PCR检测

取100 mg组织置入EP管内，加入Trizol进行组织溶解，加入0.3 ml氯仿，室温下震荡30 s，放置30 min，取上层清亮液体移入另一EP管，加入等体积的异丙嗪溶液，室温放置30 min，1 000 r/min离心10 min，取沉淀物为RNA，加入75%乙醇溶液1 ml，溶解后1 000 r/min离心10 min，取上清液，加入20 μl DEPC水计算RNA浓度，单位为：μg/μl。采用SuperScript Ⅳ逆转录试剂盒(Invitrogen SuperScript Ⅳ反转录酶 赛默飞公司)进行cDNA合成，采用金斯瑞oligo进行引物合成和设计，β-actin作为内参，miRNA-21引物上游:CTTTGAGGTGCGTGTTT 下游:CAGTGCTCGCTTAGTGC，设置3组复孔，取平均值，CISILE2018高通量PCR仪器购自常州福生生物技术有限公司。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 宫颈癌组和对照组的miRNA-21表达情况对比

宫颈癌组织中miRNA-21相对表达量为(4.82±1.62)，显著高于对照组的(1.40±0.57)，差异具有统计学意义(t=18.858,P<0.05)。

2.2 miRNA-21表达与宫颈癌病理学特征的关系

不同FIGO分期、是否发生淋巴结转移及3年不同随访结局的宫颈癌患者宫颈癌组织中miRNA-21相对表达量组间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；不同病灶大小、不同肌层浸润深度的宫颈癌患者miRNA-21相对表达量组间比较差异不具有统计学意义(P>0.05)；见表1。

表1 miRNA-21表达与宫颈癌病理学特征的关系

2.3 miRNA-21表达与宫颈癌患者预后的多因素分析

采用Logistic回归分析，提示FIGO分期增高、发生淋巴结转移、miRNA-21相对表达量升高是宫颈癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)；见表2。

表2 多因素分析结果

3 讨论

宫颈癌的发生主要考虑与高危型HPV病毒感染导致的宫颈柱状上皮细胞异常增殖有关，在HPV16或者HPV18感染的过程中，宫颈癌的发生风险可持续上升[6]。宫颈癌患者放化疗后，其远期病情进展的风险仍然较高，远期宫颈癌患者临床病理特征的恶化仍然明显[7]。部分临床随访观察研究发现，宫颈癌患者的远期复发转移的风险可超过15%以上，5年内的病死率可超过18%以上，整体临床预后不佳[8]。通过对于宫颈癌患者临床预后的评估，能够在宫颈癌的综合性诊疗过程中发挥作用，从而提高宫颈癌患者临床预后的随访效果。宫颈鳞状细胞癌上皮细胞抗原能够在宫颈癌的临床预后中发挥评估作用，但依靠鳞状上皮细胞抗原评估宫颈癌临床预后的可参考性较低，其对于宫颈癌患者临床预后评估的吻合率不足40%[9]。肿瘤基因或者微小RNA相关因子的波动，能够在宫颈癌的发生及中晚期病情进展中发挥作用。而本次研究通过对于宫颈癌患者病灶组织中miRNA-21的表达分析，能够为临床上宫颈癌的诊疗提供预后参考指标。

miRNA-21作为微小RNA家族相关成员，其主要表达于癌细胞膜周边及上皮细胞质内，在肿瘤细胞癌基因的错配修复过程中，miRNA-21导致的癌基因的激活，能够显著提高柱状上皮细胞的增殖速度。miRNA-21对于癌细胞核DNA上游转录基因的激活，能够影响到肿瘤细胞周期，导致肿瘤细胞凋亡比例的改变[10-11]。有少部分研究者探讨了miRNA-21在宫颈癌患者中的表达情况，认为在宫颈癌患者病灶组织中，miRNA-21基因转录扩增水平明显上升[12-13]，但缺乏对miRNA-21表达与宫颈癌预后的关系分析。

本次研究发现在宫颈癌患者病灶组织中，miRNA-21基因的扩增水平明显高于宫颈良性病变组，统计学差异明显，表明miRNA-21在宫颈癌患者病灶组织中存在较高的表达阳性，之所以存在较高的miRNA-21表达，主要由于肿瘤细胞癌基因转录激活程度的上升，导致了非编码RNA合成速度的增加。在其他的观察研究中，也有部分研究者观察到，在宫颈鳞状细胞癌患者中，miRNA-21基因的表达阳性率可超过65%以上，在HPV16或者HPV18感染的患者中，miRNA-21基因的扩增水平可继续上升[14]。本次研究也发现了miRNA-21的表达与宫颈癌患者临床整体性病情的关系，发现在FIGO分期较晚或者合并淋巴结转移的患者中，miRNA-21基因的扩增水平较高，表明miRNA-21的扩增水平的上升，能够显著促进宫颈癌患者临床分期的进展，加速盆腔淋巴结的转移过程。分析其中的原因，主要考虑由于miRNA-21基因扩增水平的上升，能够提高柱状上皮细胞内肿瘤信号通路蛋白的激活程度，提高了癌细胞生物学行为的恶化速度，最终促进了肿瘤浸润范围的增加，加速了肿瘤细胞对于淋巴结内皮组织的粘附能力[15]。但在不同浸润深度或者组织分化程度的患者中，并无发现miRNA-21的表达差异，表明miRNA-21的表达并不会影响到宫颈上皮细胞的分化成熟过程。在死亡组或者预后不佳的患者中，miRNA-21基因的扩增水平较高，表明miRNA-21能够影响到宫颈癌患者的临床预后。危险关系分析也发现，FIGO分期增高、发生淋巴结转移、miRNA-21相对表达量升高是宫颈癌患者不良预后的独立危险因素，临床上可以通过检测miRNA-21基因扩增水平，进而评估宫颈癌的临床预后。

综上所述，在宫颈癌患者中miRNA-21基因扩增水平明显上升。miRNA-21的上调还能够影响到宫颈癌的临床分期、淋巴结转移及临床预后。