老年肺癌组织中EGFR突变的影响因素分析及与肿瘤病理学研究

陈辉娥 姜训忠 聂 鸿 李延东 周 芳 潘 琪

肺癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，随着老龄化社会加重，近些年肺癌发病率逐年升高，居我国癌症死亡率首位，是老年人死亡原因首位，其中80%为非小细胞肺癌，多数就诊时已处于晚期[1]。虽然临床上治疗肺癌方法较多，如传统手术、放疗、化疗等，然而这些方法效果均差，随着分子生物学发展和靶向治疗进展，EGFR靶向治疗取得重大突破。廖志文[2]报道称酪氨酸激酶抑制剂能显著延长患者生存期。EGFR为酪氨酸激酶受体家族，是1种跨膜蛋白，由细胞外配体结合域、疏水跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成，能和配体结合营销细胞内酪氨酸激酶磷酸化、下游信号通路激活和适配器分子作用，从而参与细胞增殖、分化和血管形成、转移。EGFR突变主要发生在编码细胞内酪氨酸激酶结构域18-21外显子，最常见突变部位为19外显子和21外显子L858R点突变。因EGFR突变后不依赖配体结合激活酪氨酸激酶磷酸化，会自动启动下游信号通路，造成肿瘤复发[3]。报道[4]指出，EGFR突变和性别、种族、吸烟、病理类型均有关，而在检测中以肺癌组织特异性、敏感度最高，常作为其他标本对比检测结果金标准。肺癌组织标本获取依赖手术、支气管镜或穿刺等，结合现代医学技术，肺癌组织获取度相对较易。基因此，本次研究总结老年EGFR突变影响因素及与肿瘤病理学特征相关性，以期针对性治疗，提高疗效。

1 材料与方法

1.1 临床资料

回顾性分析2016年06月至2019年01月收治的共264例肺癌组织样本。年龄60～85岁，平均(64.65±2.68)岁；男性154例、女性110例；吸烟史：有106例、无158例；病理类型：腺癌191例、鳞癌45例、大细胞癌20例、小细胞癌8例。

1.2 纳入标准

①年龄60～85岁；②均签署知情同意书；③检查前未行放化疗；④依次性好，能配合完成问卷调查。⑤均经组织病理学确诊。

1.3 排除标准

①年龄<60岁；②无法进行操作无法获取肺癌组织标本者；③特殊人群，如精神病，严重肝功能损害、心血管意外不能耐受调查治疗者。④病理资料不完整。

1.4 研究方法

由上海强生检验中心进行检测，将收集的肺癌组织取约5 g进行检测，先将组织研磨好后加入细胞裂解液5 ml，室温下放置30 min，以3 000 r/min离心5 min。1 ml裂解液中加入0.2 ml氯仿进行裂解。采用无酶RNA冲洗液进行洗涤，再次离心5 min。将以上混合液加入逆转录酶MMLV，在70 ℃下干浴3 min。再加入逆转录酶0.5 μl，在恒温下水浴1 h，室温放置5 min促使其溶解转录为cDNA。再在反应体系中加入SYBR Green染料，经正向、反向引物后上机，进行40个循环操作。操作条件为93 ℃ 2 min和1 min，再55 ℃ 2 min。使用由江苏盖尔克生物科技有限公司提供的PCR产物扩增基因多态性检测，加入对应延伸引物进行单碱基测序反应。使用PCR引物软件进行检测。

在突变率上从临床病理类型比较，在浸润程度上根据肺腺癌进行对比。在影响因素上从吸烟、淋巴结转移、临床分期、胸膜侵犯、性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、基础疾病、病程、家族史、既往肺部疾患等进行比较，多因素采用非条件Logistic回归分析。

1.5 统计学处理

对文中所得数据应用SPSS 19.0软件处理，组间资料采用卡方检测，单影响因素采用Kaplan-Meier法检测，多因素采用非条件Logistic回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同病理类型EGFR突变比较

不同病理类型肺癌组织中，腺癌EGFR突变率57.59%，远高于其他病理类型比率(P<0.05)，在肺腺癌浸润程度中，浸润性肺腺癌EGFR突变率66.9%，远高于其他浸润程度肺腺癌(P<0.05)，见表1，表2。

表1 不同病理类型肺癌组织中EGFR突变情况比较(例，%)

表2 肺腺癌浸润程度EGFR突变比较(例，%)

2.2 老年肺癌组织EGFR突变影响因素比较

老年肺癌组织EGFR突变单危险影响因素有吸烟、淋巴结转移、临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、胸膜侵犯、女性(P<0.05)，而与年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、基础疾病、病程、家族史、既往肺部疾患无关(P>0.05)，见表3。

表3 老年肺癌组织EGFR突变影响因素比较(例，%)

2.3 EGFR突变独立影响因素分析

经非条件Logistic回归分析，吸烟、淋巴结转移、临床分期、胸膜侵犯、女性是老年肺癌组织EGFR突变独立影响因素(P<0.05)，见表4。

3 讨论

肺癌是我国老年人发病率和死亡率最高恶性肿瘤，发病率为73.3/10万，标化病死率为诶39.8/10万，其中有80%肺癌为吸烟所致，在病理类型上以腺癌最常见[5]。因肺癌早期缺乏典型临床症状，80%患者就诊时已经处于晚期，失去手术治疗机会，放化疗是目前肺癌主流治疗手段。但随着靶向治疗逐步发展，其针对性强、有效期高、缓解期长、不良反应小是EGFR治疗优势所在。但随着临床运用，EGFR突变成为影响其疗效的重要因素，不仅降低疗效，且EGFR突变后影响机体免疫功能，进一步降低患者生活质量，故逐渐引起临床重视。

报道[6-7]将EGFR作为肺癌治疗靶点，以求通过作用于细胞内活性氧或一氧化氮生成EGFR抑制肺癌细胞增殖和分化；或是促进EGFR配体表达上调从而导致EGFR过度激活，影响EGFR构象或激酶结构域，通过细胞膜影响EGFR分布情况，也能诱导氧化应激和内皮网应激反应吗，从而抑制EGFR激活。

在影响因素上，吸烟是独立影响因素，因烟草中含有亚硝酸盐类物质，这类物质可通过BaP细胞色素P450s酶系催化代谢重要产物，其能和核酸碱基和蛋白质氨基酸残基亲核基团共价结合形成合物导致DNA损伤[8]。烟草中丁酮、n=亚硝基甲氨基能转移DNA和蛋白质等分子形成加合物，直接引起基因DNA损伤，导致基因突变、染色体畸变、细胞死亡，诱导肿瘤进展。而在临床分期上Ⅲ～Ⅳ期为独立危险因素，因EGFR可通过络氨酸磷酸化促进癌细胞膜糖蛋白激活，促进癌细胞周期性调控，从而依赖性激活蛋白转录和翻译，增加G1/S期比率，降低G0细胞数量[9]。其在淋巴结转移上主要原因是EGFR能对癌细胞病灶组织局部新生血管发挥促进作用，能提高局部肿瘤组织血流灌注，增加癌细胞浸润和扩散风险性。对胸膜侵犯是独立因素是因为EGFR蛋白能降低细胞间锚合、缝隙、紧密连接，可下调细胞基底膜完整性，促进癌细胞转移和浸润。研究[10]指出，女性对EGFR突变者19外显子的抑制作用较EGFR外显示21强，19外显子连接蛋白磷酸化在一定程度上修饰残基结合，导致EGFR降解减少，其衔接蛋白磷酸化下降EGFR-1173残基结合，导致RAS通路活性下降。而在性别因素上以女性较多，这点在临床上缺乏大量依据，结合现代理化因素，可能和女性使用化学物质有关，因化妆品中含量微量金属元素，而这些元素能激活EGFR赖氨酸激活酶活性，下降MEK-1，如钒可引起Ras医疗丝氨酸磷酸化，促进DNA和NF结合。锌则能通过c-src激酶而不依赖EGFR聚集和自身激酶活性[11]。

表4 老年肺癌组织EGFR突变独立影响因素分析

连亚莉[12]指出，EGFR突变对淋巴结浸润影响是和淋巴结黏附因子表达有关，而在临床分期上主要是癌细胞变形能力、浸润能力和对基底膜组织突破力有关。马晓燕[13]则通过对比EGFR突变类型，从性别、年龄、病理类型、TMN分期、脑转移、放疗、化疗等进行归纳，比较19/21外显子在疗效上区别情况，从而总结出19外显子EGFR突变预后更好。孙晓远[14]则通过对比EGFR突变型和EGFR野生型，从而对比其在无进展生存期和总生存期变化情况，旨在说明EGFR对生存期影响价值。而本次研究从淋巴结转移、胸膜侵犯等角度进行归纳，旨在说明EGFR突变对疗效影响性，归纳因素符合肺癌晚期临床特征，实用性强，但本次研究中未对EGFR突变类型和影响因素进行匹配，同时未将治疗方案和EGFR突变之间进行对比，对临床指导价值仍有待提高，仍有进一步探讨空间。