长效伊维菌素注射液在山羊体内的药动学研究

段培强, 潘方燕, 曾杨梅,陈红伟,姜 波, 吴俊伟,

1. 西南大学 动物科学学院，重庆 荣昌 402460：2. 重庆布尔动物药业有限公司，重庆 荣昌 402460

伊维菌素[1-2]是一类高效、广谱、低毒性的大环内酯类抗寄生虫药物，对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物有良好的驱杀作用，深受广大养殖户的好评．但其存在较多的缺陷，如药效时间短，需反复多次给药，吸收不充分，生物利用度低等[3-4]．本研究旨在研发一种药效时间更长，吸收利用率更高，毒副作用更小的伊维菌素注射液，并为该药物的生产使用提供相应的理论数据．

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品

1%长效伊维菌素注射液，重庆布尔动物药业有限公司提供，规格：100 mL∶1 g，批号：161225：1%普通伊维菌素注射液，重庆布尔动物药业有限公司提供，规格：100 mL∶1 g，批号：161218：伊维菌素对照品，含量为93.8%，批号：0190812，中国兽医药品监察所：甲醇(HPLC)：安徽天地高纯溶剂有限公司：乙腈(HPLC)：安徽天地高纯溶剂有限公司．

1.1.2 衍生化试剂

N-甲基咪唑、三氟乙酸酐：美国Sigma公司．

1.1.3 仪器设备

JE202型电子天平：TD4K型台式低速离心机：UItiMate3000型高效液相色谱：色谱柱：AcclaimTM120 C18(5 μm 120 A 4.6 mm×250 mm)：D-37520型台式高速离心机：DW-86L338型超低温冷藏柜：XW-80A型涡旋混合仪器．

1.1.4 试验动物

健康荣昌本地黑山羊12只，雌、雄各半，体质量为(24.08±2.89) kg，正常饲养管理．以青绿牧草为主，精料为不添加抗寄生虫药物和抗生素的全价饲料，自由饮水，试验前临床观察3 d．试验开始前进行随机分组，并采血检查．确保所有试验用山羊的血液中不含有伊维菌素．

1.2 伊维菌素含量测定方法

用高效液相色谱(HPLC)法测定药物的准确含量，所得结果用于计算准确的给药量，以保证实验数据的准确性和可靠性．

1.2.1 色谱条件

检测波长：254 nm：流动相：甲醇∶乙腈∶水=35∶53∶12：流速：1.0 mL/min：进样量：20 μL：柱温：30 ℃

1.2.2 药物稀释

将1%伊维菌素注射液配置成0.2 mg/mL的质量浓度．精密量取2 mL伊维菌素溶液，置100 mL容量瓶中，用色谱级无水甲醇定容，摇匀，再用0.22 μm的有机滤头过滤即得．长效和普通伊维菌素注射液分别配置3个批次．

1.3 药动学试验方法

1.3.1 给药及血样采集

将12只山羊随机分为A、B两组，A为长效伊维菌素注射液组(简称：长效组)，B为普通伊维菌素注射液组(简称：普通组)．按0.2 mg/kg的剂量单次皮下给药，给药后1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h，144 h，240 h，336 h，432 h，528 h颈静脉采血，每次采血样3 mL，放置在5 mL含肝素钠的离心管中，混匀，3 000 r/min离心10 min，吸取上层清液，放置在-20 ℃冰箱内，待用．

1.3.2 血浆样品处理

往装有0.5 mL血浆的离心管中加乙腈1 mL，涡旋30 s，然后14 000 r/min离心5 min，取上清液置于10 mL离心管中，并往其中加入乙酸乙酯4 mL，涡旋1 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液置于另一新的10 mL离心管中，再向残渣中加入2 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液，50 ℃氮气吹干，待衍生化．

1.3.3 衍生化

往试管中加衍生化试剂A (N-甲基咪唑∶乙腈=1∶1)100 μL，涡旋混匀30 s：再加衍生化试剂B(三氟乙酸酐∶乙腈=1∶2) 150 μL，涡旋混匀30 s，密封避光，室温下放置15 min，再往其中加入750 μL甲醇，涡旋混合30 s，过0.22 μm有机滤膜，装入2 mL棕色进样瓶中，供高效液相色谱(HPLC)测定．

1.3.4 色谱条件

流速：1.5 mL/min：进样量：20 μL：柱温：35 ℃：荧光检测：激发波长365 mm，发射波长：475 mm：洗脱梯度见表1．

表1 洗脱梯度

1.4 方法学验证

1.4.1 标准曲线的建立

用伊维菌素对照品配置5 μg/mL和0.5 μg/mL的原液，再取一定量的原液加入到空白血浆中，使其质量浓度为100 ng/mL，50 ng/mL，25 ng/mL，5 ng/mL，1 ng/mL，经蛋白处理和衍生化后用高效液相色谱(HPLC)进行检测，得出相应数据．以峰面积的比值(S)对质量浓度(C)作线性回归，求出回归方程和相关系数．相关系数(R)要求大于0.99．

1.4.2 精密度与准确度测定

精密度用批内和批间的相对标准偏差值(RSD)来考察，RSD值应小于15%．准确度应在85%～115%范围内．用伊维菌素对照品配置100 ng/mL，50 ng/mL，5 ng/mL共3个质量浓度的样品，每个质量浓度配置5份，配置方法与1.4.1相同．连续3 d测定3个不同批次的样品即可．

1.4.3 提取回收率

用伊维菌素对照品配置100 ng/mL，50 ng/mL，5 ng/mL共3个质量浓度样品，每个质量浓度配置5份，配置方法与1.4.1相同．要求回收率大于70%．

1.5 数据处理及统计分析

药时数据用3p97软件处理．选择出最适宜的药物代谢动力学模型．药动学参数、血药质量浓度显著性分析用SPSS软件处理．

2 结 果

2.1 伊维菌素含量测定

长效组的准确含量为标示量的101.73%，普通组的准确含量为标示量的109.54%，符合兽药典的规定．测定峰面积结果见表2，色谱图见图1．

表2 HPLC法测定伊维菌素的峰面积

2.2 回收率、标准曲线及变异系数

伊维菌素在质量浓度为1 ng/mL～100 ng/mL的范围内线性关系良好，回归方程为y=4 475x+3 075(y为药物峰面积，x为药物质量浓度)，相关系数r=0.999(图2)．以100 ng/mL，50 ng/mL和5 ng/mL 3个添加质量浓度测定血浆样品中伊维菌素的回收率分别为95.79%±1.33%，92.8%±0.87%，76.72%±1.09%，批间变异系数分别为0.46%，0.56%，0.63%：批内变异系数分别为0.5%，0.35%，0.93%(表3)．本试验的色谱峰型尖锐，血浆中杂质分离良好，无明显的干扰峰(图3)．

图1 HPLC法测定伊维菌素的峰面积色谱图

图2 伊维菌素在山羊血浆中的标准曲线

表3 回收率及变异系数

图3 伊维菌素专属性高效液相色谱图

2.3 山羊体内的药动学特征

不同时间血药质量浓度实测平均值见表4，相应的药动学参数见表5，相应的药时曲线见图4．

表4 山羊体内各时间点的血药质量浓度

表4 A、B两组的药动学参数值

图4 A、B两组的药时曲线

3 结 语

分析A、B两组的主要动力学参数可知，改良处方及生产工艺的长效伊维菌素注射液在山羊体内吸收更充分、更完全，降低了毒副作用，延长了半衰期．长效组的达峰质量浓度(Cmax)为10.981 9 ng/mL，达峰时间(Tpeak)为25.226 3 h，与普通组的Cmax值(8.722 8 ng/mL)和Tpeak值(22.107 3 h)相比较，长效组药物在体内达峰时间更长且质量浓度更高，其安全性更佳，药效更好．长效组的AUC值为 2566.770 9(ng/mL)×h，比普通组的AUC值增加了1 517.415 1(ng/mL)×h，表明其分布更广泛、更均匀，作用时间相对延长，起到缓释长效的作用．

分析其原因，可能是与长效组药物血浆蛋白结合率变高有关．药物在体内以结合型和游离型两种状态存在，仅游离型药物分子易被分布代谢[5]．当结合率变高，使得血管内游离的药物分子减少，药物吸收更加完全，并且避免了药物短时间，高质量浓度地集聚在作用部位而出现毒副作用[6-7]．药物在代谢过程中，结合型的药物分子不能被机体所代谢[8-9]，且机体内游离的药物分子和结合型的药物分子处于一种动态平衡状态，药物与血浆蛋白结合率变高，游离的药物分子减少，故能有效地延长药物的代谢时间，达到长效的目的．