糖氧剥夺对大鼠脂肪干细胞自噬和成脂的影响*

袁志坚 吴小瑜 何文涓 丁亚明 钟晓春

(1.无锡卫生高等职业技术学校，无锡 214028)(2.杭州师范大学医学院，杭州 311121)

细胞自噬是近年来尚待进一步认识的且与细胞生长繁殖相关的重要知识。目前对自噬有两种观点：一种为自噬不利于细胞正常生长。左旋棉酚可能通过诱导细胞自噬下调B淋巴细胞刺激因子(B lymphocytestimulator stimulctor，BLyS)的表达，从而抑制细胞生长[1]；另一种为自噬有利于细胞生长。贾绍辉等[2]发现在正常情况下，运动可以诱导机体多种组织细胞自噬的激活，心肌细胞的自噬激活对于维持心肌自身功能有重要的作用。大量研究表明，自噬在细胞新陈代谢和生理功能上有双重作用，在疾病发生的不同时期，自噬起到不同的作用，需要根据具体细胞生长条件确定[3-5]。因此，本研究以缺糖缺氧状态下，大鼠ADSC为研究对象，在体外研究自噬参与ADSC移植的作用及机制，最终目标是探索移植过程中提高ADSC存活及成脂的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

血清购自杭州万研科技有限公司；低糖DMEM培养基(含青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL)及EBSS(Earle′s平衡盐溶液)购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；Ⅰ型胶原酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司、Western blot及IP细胞裂解液、蛋白上样缓冲液和预染蛋白marker购自上海碧云天生物技术有限公司；pmTOR和LC3兔单抗购于cell;Actin兔单抗购自杭州华安生物公司；羊抗兔Anti-Rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)购自Cell Signaling；蛋白印迹凝胶电泳试剂盒购自武汉谷歌生物技术公司；Micro BCA Protein Assay Kit购自Pierce；PVDF膜购自Millipore；CoCl2、胰酶消化液、离心管、EP管及移液枪头购自国药集团化学试剂有限公司；电泳转膜设备购自Bio-rad；OriCell SD大鼠ADSC成脂诱导分化培养基试剂盒购自Cyagen；SD大鼠购自上海斯莱克公司，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2016-0004，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2016-0014。动物实验经合作单位杭州师范大学实验动物福利伦理审查批准，编号：2017-1002。

1.2 方法

1.2.1ADSC培养:参照何文涓等[6]报道，选择SPF级，雄性SD大鼠，体质量为150～200 g，20只，6～8周龄。将大鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出大鼠的脂肪组织浸于DMEM基础培养基中，按常规进行洗涤，去除脂肪组织中肉眼可见的纤维及血管成分，加入0.1%的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃下消化40 min，然后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化。100目滤网过滤，1 300 r/min离心10 min，弃去上层漂浮的脂肪细胞和培养液，沉积的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液转移至培养瓶中，置于37 ℃、饱和湿度和5%CO2培养箱中培养，待细胞达80%左右融合率时即可进行传代，更换培养液1/3～1/2，然后继续培养观察。根据细胞生长状态及培养基颜色变化，2～3 d换液1/3～1/2，经数代培养及成脂诱导观察为ADSC。

1.2.2MTT实验:将上述ADSC胰酶消化，计数细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板，37 ℃培养箱放置1 d。分别设置对照组(G组，10%胎牛血清的低糖DMEM)、少糖组(SG组，10%胎牛血清的无糖DMEM∶低糖DMEM=1∶1)、缺氧组(G+CoCl2，含10%胎牛血清的低糖DMEM+100 μmol/L的CoCl2)和缺氧少糖组(SG+CoCl2组，含10%胎牛血清的无糖DMEM∶低糖DMEM=1∶1+100 μmol/L的CoCl2)。每组3孔，混匀后继续培养，分别于第2、3和4天，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，混匀后置于37 ℃培养箱中，培养4 h后，1 000 r/min离心5 min，去上清，然后每孔加入150 μL DMSO，振荡混匀溶解，酶标仪上490 nm检测光密度OD值。

1.2.3Western blot分析:取培养第3代的大鼠ADSC，胰酶消化离心回收，按照2×106/瓶接种到培养瓶中，置于37 ℃培养箱过夜。第2天分别设置G组、SG组、G+CoCl2组、SG+CoCl2组和EBSS组(自噬阳性对照组，10%胎牛血清的低糖DMEM+5 mL的Earle′s平衡盐溶液)，所有组分别取培养第3代ADSC，用PBS冲洗三次，各组分别进行相关的处理后，EBSS组细胞37 ℃培养箱培养3 h后，其余组放置细胞培养箱24 h后，回收细胞。按照Western blot及IP细胞裂解液说明提取蛋白，用试剂盒Micro BCA Protein Assay Kit测试样本中蛋白质含量，PBS调整蛋白浓度一致，100 ℃水浴5 min后冷却、分装，-80 ℃保存备用。

12%的聚丙烯酰胺上样，60 V电泳30 min，120 V电泳至溴酚蓝接近底部，停止，转膜PVDF，5%脱脂牛奶封闭1 h，样本PVDF膜剪成三份，分别置于Actin兔单抗、pmTOR兔单抗和LC3兔单抗反应液中4℃摇床过夜。第2天，TBST漂洗三次后，置于羊抗兔Anti-Rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)反应液避光反应2 h后，TBST避光漂洗三次，然后置于 Odyssey近红外扫描仪上成像保存。

1.2.4成脂诱导后油红“O”染色及比色实验:取第三代ADSC，胰酶消化回收，细胞计数，以每孔接种2 mL，浓度为1.5×104个/mL的细胞于直径为3 cm细胞培养皿中，放置37 ℃细胞培养箱中培养。

参照OriCell SD大鼠脂肪间质干细胞(adipose stem cell,ASC)成脂诱导分化培养基试剂盒使用说明，配制不同组别的诱导分化培养基，分别为 A液和B液4 ℃保存备用。

细胞100%融合后，去除皿内培养液，加成脂诱导剂A液系列2 mL，3 d后去上清，加成脂诱导剂B液系列作用24 h，如此A、B液系列交替三次；继续B液系列维持2 d 换液一次，6 d后停止。弃上清，PBS冲洗两次，加入2 mL 4%中性甲醛溶液30 min，弃上清，PBS冲洗两次，加入1 mL 油红“O”染料工作液30 min，弃上清，PBS冲洗两次，显微镜下观察摄像，加40%异丙醇1 mL，洗去油红“O”染料背景色，弃上清加500 μL异丙醇作用30 min，吸取300 μL进入96孔板中，490 nm测量OD值。

1.2.5图像数据处理：Odyssey近红外扫描仪操作软件拍照。测试数值用Excel自带统计函数，t检验分析并作图。

2 结果

2.1 大鼠ADSC的培养

分离大鼠ADSC，37 ℃培养48 h后，细胞部分贴壁生长，以梭行为主(图1A)，同时悬浮的液体里可见漂浮的细胞和杂质。经3～4次换培养液后，贴壁细胞接触生长至约80%，更符合纤维细胞形态(图1B)，悬浮的细胞和杂质更少，并出现少量油脂样颗粒。此后消化传代，继续培养，传代三次后，当细胞再次接触生长至约80%时，进行后续实验。

图1 大鼠ADSC培养不同时间(×100)

2.2 不同培养条件下ADSC增殖变化

培养三代后的大鼠ADSC，胰酶消化后接种至96孔细胞培养板。在不同培养条件下(缺糖缺氧)分别作用24 h、48 h和72 h。MTT分析结果，随着时间延长，ADSC细胞均有增殖，48 h达到最大，72 h进入平台期。培养24 h，G组与其它三组比较没有统计学差异(P>0.05)，而48 h，G组细胞增殖明显高于其它三组(P<0.05)，进入平台期(72 h)，G组细胞增殖仍然高于其它三组(P<0.01)，如图2所示。

图2 MTT检测细胞存活生长状态

2.3 自噬相关基因pmTOR和LC3的表达

上述培养条件作用24 h后，回收细胞进行基因表达Western blot分析，EBSS组、G组和的SG组LC3-Ⅰ明显弱于LC3-Ⅱ，表明G组和SG组的细胞自噬与EBSS组接近，而G+CoCl2组和SG+ CoCl2组的LC3-Ⅰ明显高于EBSS组，表明CoCl2抑制了细胞自噬，5个实验组的pmTOR未见明显变化，则说明实验中细胞自噬的变化与pmTOR无关(图3)。

图3 Western blot分析蛋白表达荧光二抗扫描

2.4 成脂诱导油红“O”染色及比色

5个实验组的ADSC经成脂诱导油红“O”染色，G组细胞数目多且橘红色脂粒丰富，而SG+CoCl2组细胞和脂粒均稀少(图4)。异丙醇溶解脂滴中的油红“O”染料，经490 nm比色，发现G组OD值最大。与G组比较，SG组、G+CoCl2组及SG+CoCl2组均有统计学差异(P<0.05)。其中SG+CoCl2组降低明显(P<0.01)，而在G+CoCl2组中，CoCl2的加入，与G+CoCl2组油红“O”比色，OD值更低，差异极显著(P<0.01)，如图5所示。

图4 成脂诱导后油红“O”染色显微镜观察(×100)

图5 油红O染色490 nm的OD值

3 讨论

本研究结果与周明辉等[7]报道相一致，而糖氧剥夺对大鼠ADSC增殖变化情况表明少糖、缺氧条件明显影响ADSC的生长状态，CoCl2诱导的化学缺氧对细胞的生长起抑制作用[8]。在自噬相关基因pmTOR和LC3的表达研究中发现，G组细胞自噬LC3与EBSS组接近，说明正常培养的细胞自噬旺盛，推测一定程度上细胞自噬是细胞的一种自我保护机制，这种自噬情况可参考贾绍辉等[2]报道，即：自噬为在饥饿状态下，脂肪细胞存活中发挥保护性作用，提高自噬水平有助于降低饥饿状态下脂肪细胞的凋亡水平[9]。SG组的LC3表现与G组和EBSS组接近，推测可能是LC3-Ⅰ已经降解完毕，再增加自噬也不起作用。在此情况下，缺糖也可以抑制细胞自噬，需要进一步研究。G+CoCl2组可见LC3-Ⅰ的含量增加，说明自噬受到抑制，这与韩苗苗等[10]报道相一致。SG+CoCl2组与G+CoCl2组，没有明显的区别，推测可能是少糖的量不足以对抗化学缺氧剂CoCl2的作用(图3)。此外，pmTOR的量各组均无明显的区别，则表明上述细胞自噬分子信号途径不通过pmTOR，实际上可能如尹长伟等[11]报道，缺糖是通磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)，缺氧是通过低氧诱导因子1-α/自噬相关基因(HIF1-α/Beclin)的自噬效应途径。Karabiyik等[12]研究报道，糖剥夺通过AMP依赖蛋白激酶(AMPK)依赖的方式，经下游蛋白激酶复合体(ULK1)分子介导FYVE手指的磷酸肌醇激酶(PIKfyve)活化诱导自噬。参照李德全等[13]和Yamaguchi等[14]实验，经比色分析，G组OD值最高。与G组比较，另外三组OD值均明显降低(P<0.01～0.05)，而且SG+CoCl2组降低最明显(P<0.01)，说明缺糖缺氧是脂肪移植成败的重要因素。细胞自噬的研究，一般地认为是细胞保护自救，但生物的复杂性使其不完全如此。处于危机状态的细胞，自噬反而可能是导致细胞死亡的主要原因。在本研究中，推测自噬本身也是一种消耗能量的过程，在缺氧(G+CoCl2组)和缺氧缺糖(SG+CoCl2组)的条件下，能量极度缺乏，所供能量无法支持细胞自噬的进程，因此自噬也受到抑制。本研究认为大鼠ADSC具有较强的细胞自噬作用，在糖氧剥夺下抑制细胞自噬，降低ADSC的存活率以及ADSC诱导分化成脂率。