羊水性染色体嵌合的细胞及分子遗传学分析

崔 科，白 霞，剡红民，贾 婷，强 荣

(西北妇女儿童医院，陕西 西安 710061)

单个受精卵产生并具有两种或多种不同基因型的细胞群的个体称为嵌合体，其中具有两种或多种性染色体核型的嵌合体为性染色体嵌合体[1]。性染色体嵌合可能会导致胎儿性器官发育不完全，增加生殖细胞肿瘤的发病风险，且异常核型位置、所占比例等的多样性增大了产前诊断和遗传咨询的复杂性[2]。染色体核型分析技术是产前诊断中染色体嵌合体检测的“金标准”，可以检出非整倍体以及较大片段的核型异常，但其诊断周期长，且对于染色体的微小缺失和重复无法明确诊断，而染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)、染色体拷贝数变异(copy number variation，CNV)检测对于染色体微缺失/微重复等的检出具有独特优势，但不能检出染色体平衡易位、倒位以及低比例异常嵌合[3]。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术可以直接检测未培养羊水细胞间期细胞，明确胎儿染色体结构异常的来源和准确定位断裂点，对最常见的非整倍体作出快速的产前诊断[4]。

本研究拟探讨细胞和分子遗传学技术联合应用在性染色体嵌合体产前诊断中的价值，以为羊水性染色体嵌合体的遗传咨询提供参考。

1研究对象与方法

1.1研究对象

选取2018年1月至2020年12月在西北妇女儿童医院产前诊断中心符合介入性产前诊断指征并行羊膜腔穿刺术，接受细胞和/或分子遗传学分析的5 158名孕妇为研究对象，其中染色体核型分析和FISH检测各5 158例，CMA检测2 542例，CNV检测770例，进一步分析40例性染色体嵌合体病例，对妊娠结局进行随访。所有孕妇及家属均进行检测前咨询，并签署产前诊断知情同意书。

1.2检测方法

1.2.1采集羊水标本

经知情同意，孕妇在超声引导下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水30～40mL(弃去最初的1～2mL，以避免母体细胞污染)，其中羊水细胞染色体核型分析培养20mL，FISH检测10mL，CMA/CNV检测10mL。

1.2.2染色体核型分析

将20mL羊水分别注入2支无菌离心管，离心后在无菌操作条件下接种于2个培养瓶中，独立于2个培养箱中静置培养，设置培养条件为37℃和5%～6%CO2。观察细胞生长情况，7d后换液，上清液置于第3个培养瓶中继续培养备用，原培养瓶加培养基后继续培养。2～3d后，进行原位收获、制片和常规G显带。计数20个分裂相细胞，分析5个核型，记录染色体数目和结构异常情况，若出现嵌合型或异常核型则加大计数。

1.2.3 FISH检测

对10mL羊水标本选用产前诊断染色体检测试剂盒探针(北京金菩嘉医疗科技有限公司)，按说明书进行常规操作处理。其中绿色的CSPX探针定位于Xp11.1-q11.1，红色的CSPY探针位于Yp11.1-q11.1。荧光显微镜下对细胞进行分析计数，正常细胞占比>90%为正常样本，异常细胞占比>60%为异常样本，异常细胞占比10%～60%为嵌合型。

1.2.4 CMA/CNV检测

对未培养的10mL羊水，按照Wizard®基因组DNA 纯化试剂盒(中国北京天根生化公司)说明书进行操作，提取基因组DNA。知情同意后，根据孕妇的选择，进行CMA或CNV检测。CMA检测：选取SurePrint G3 Human CGH Microarray 8×60K CGH芯片(美国 Agilent 公司)，操作步骤严格遵循Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit试剂盒说明书。CNV检测：使用NextSeq CN500测序平台测序。参考DGV、UCSC、DECIPHER、ISCA、ClinGen、OMIM、NCBI PubMed等数据库对检测出的CNVs进行解释和分析。

1.3诊断标准

当两种及以上培养物中均出现两个及以上的异常核型且异常核型相同为真嵌合体；两种及以上培养物中均出现不同的异常核型，或两种及以上培养物中只存在单个异常细胞，或不同核型均只在相同培养物中存在为假嵌合体[5]。

2 结果

2.1 产前诊断指征

5 158例羊水样本中检出40例性染色体嵌合体，发生率为0.78%。产前诊断指征包括无创产前基因检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)异常(26例，65.00%)、NIPT性染色体异常(4例，10.00%)、血清学筛查高风险(4例，10.00%)、高龄(3例，7.50%)、羊水过多(1例，2.50%)、羊水偏多(1例，2.50%)和单脐动脉(1例，2.50%)，见表1。

2.2染色体核型分析结果

检出的40例性染色体嵌合体中，5例(12.50%)为染色体结构异常嵌合体，35例(87.50%)为染色体数目异常嵌合体，见表1。染色体结构异常嵌合体的具体情况为：(1)病例1：染色体核型分析显示其存在45,X和疑似衍生X染色体46,X,?der(X)两种细胞系，结合FISH及CNV检测结果，确定染色体核型为45,X[61]/46,X,psu idic(X)(p11.4)[39]，结构异常X染色体为假双着丝粒染色体。(2)病例2和3：染色体核型分析显示其为45,X和46,X,i(X)嵌合核型，经CMA检测准确定位，确定结构异常X染色体为i(X)(qter→q10::q10→qter)。(3)病例4：染色体核型分析显示其为45,X和46,X,del(X)嵌合核型，经CMA检测准确定位，确定结构异常X染色体为del(X)(pter→q21:)。(4)病例5：见FISH检测结果。

2.3 FISH检测结果

在选择FISH检测的40例(100.00%)孕妇中，37例(92.50%)检测结果与染色体核型分析结果一致，3例(7.50%)检测结果与染色体核型分析结果不一致(见表1)，具体情况为：(1)病例5：染色体核型分析显示其为45,X[23]/46,X,?del(Y)(q11.21)[26]嵌合体核型，但FISH检测提示为X[23]/XYYY[45]/47,XYY[32]，结合CMA检测结果，推测：①该样本中同时存在X、XYYY和XYY三种细胞系；②XYYY细胞系中，除了正常Y染色体，还有双着丝粒Y染色体；③XYY细胞系中，Y染色体是双着丝粒染色体。(2)病例6：染色体核型分析显示其为45,X[30]/46,XY[23]嵌合体核型，但FISH检测提示为X[20]/XYY[70]/46,XY[10]，结合CMA检测结果，推测：①该样本中同时存在X、XYY和XY三种细胞系；②XYY细胞系中的Y染色体是双着丝粒染色体。(3)病例7：染色体核型分析显示其为45,X[15]/46,XY[26]嵌合体核型，但FISH检测提示为X[12]/XYY[68]/XY[26]，结合CMA检测结果，推测：①该样本中同时存在X、XYY和XY三种细胞系；②XYY细胞系中的Y染色体是双着丝粒染色体。

2.4 CMA/CNV检测结果

在选择CMA/CNV检测的28例(70.00%)孕妇中，22例(78.57%)检测结果与染色体核型分析结果一致，6例(21.43)检测结果与染色体核型分析结果不一致，见表1。

2.5 妊娠结局

检出的40例性染色体嵌合体中，31例选择终止妊娠(病例13因胎儿胎心减慢引产)，终止妊娠率为77.50%；9例选择继续妊娠(8例顺产，1例剖宫产，均未见异常，病例2 性染色体异常细胞系比例较高)，继续妊娠率为22.50%，见表1。

表1 40例性染色体嵌合体的临床资料和遗传学检测结果Table 1 Clinical data and genetic test results of the 40 cases with sex chromosome mosaicism

3讨论

3.1 性染色体嵌合体的临床特征

染色体嵌合体形成的主要原因为受精后有丝分裂期间的不分离错误或染色体丢失，在染色体正常的受精卵中，异常核型细胞出现得越早，其所占比例越大[6]。NIPT通过检测母体血浆中的胎儿游离 DNA来筛查胎儿非整倍体，已经被广泛用于21三体、18三体和13三体的产前筛查。尽管NIPT对嵌合体检测的灵敏度和特异度较低，但仍具有重要的提示作用。本研究表明性染色体嵌合体的产前诊断指征主要为NIPT异常，刘文等[7]的研究也发现42.11%的胎儿染色体嵌合体的羊水标本为NIPT提示异常的标本。本研究中77.50%的检测出性染色体嵌合体的孕妇选择引产，高于既往研究的终止妊娠率[8]。虽然染色体嵌合的临床表现与异常染色体的数目和种类有关，但发育障碍与染色体嵌合比例的关系尚未有定论，且性染色体嵌合体常在青春期后才出现生殖器发育异常、生育能力低下等症状，因此对性染色体嵌合体的遗传咨询仍需谨慎解释，合理选择是否终止妊娠。

3.2 细胞和分子遗传学技术的对比

传统的细胞遗传学染色体核型分析技术可以检出染色体数目异常和部分结构重排，但不能准确诊断染色体小片段结构异常和复杂易位断裂点。本研究中染色体核型分析技术无法分辨出病例1～4的假双着丝粒染色体、确定结构异常染色体具体的断裂点，而联合CMA/CNV分子遗传学技术，不仅可以检测微小缺失或重复，还可以综合分析检测结构，确定突变类型或定位微缺失/重复断裂点等[9]。在病例5～7中，由于FISH和CMA/CNV检测采用培养前的羊水标本，检测出的45,X细胞所占比例低。而进行染色体核型分析时，由于45,X细胞系为优势生长趋势明显的细胞系，羊水培养后该细胞系比例高，染色体结构异常的XYY和XYYY细胞系比例较低，且双着丝粒Y染色体在300-500条带的G显带时不易分辨，导致核型未能检出。因此，由于采用培养前的羊水标本，避免了细胞培养后优势细胞增长等情况，FISH和CMA/CNV分子遗传学技术的检测结果更能真实反应样本情况[10,11]。本研究显示部分CMA/CNV检测结果与染色体核型分析及FISH检测结果不一致，可能是由于CMA/CNV技术在检测过程中需要对样本DNA进行PCR扩增，使得原有嵌合比例发生变化，导致无法检出较低比例嵌合体。李显筝等[12]也认为对低比例嵌合体的产前诊断，FISH检测优于CMA/CNV检测。

3.3 细胞和分子遗传学技术联合应用在产前诊断的价值

羊水染色体核型分析是目前最常用且可靠性较高的产前诊断细胞遗传学方法，但其细胞培养周期较长、检测分辨率低，存在漏诊和误诊的可能性。真嵌合会出现多种器官和智力发育障碍，而假嵌合会导致不必要的产前干预，给孕妇及其家属带来极大的身体和心理负担[13]。FISH和CMA/CNV分子遗传学技术具有诊断周期短、高通量、结果可靠等优点。联合细胞和分子遗传学技术可实现不同检测方法的优势互补，有效提高产前诊断性染色体嵌合体的准确性。本研究表明FISH和CMA/CNV检测与染色体核型分析结果具有较高的一致性。Dai等[14]对4 953例具有羊膜腔穿刺术指征的孕妇进行羊水细胞染色体核型分析和FISH检测进行产前诊断，3例为性染色体嵌合体。Zhang等[15]对104例染色体嵌合体进行分析，其中28例联合应用染色体核型分析和CMV检测，其认为需要采用不同的检测方法对性染色体嵌合的检测结果进行验证。因此，在性染色体嵌合体的产前诊断中联合细胞和分子遗传学技术有助于避免医生误判，有针对性地开展遗传咨询，有效减少对孕妇及其家属的身心伤害。

综上所述，羊水染色体核型分析是产前诊断性染色体嵌合体的重要方法，应联合细胞和分子遗传学检测技术全面地对性染色体嵌合体进行鉴别性产前诊断，以为羊水性染色体嵌合体的遗传咨询提供参考。