Beclin-1调控DNA损伤反应的作用机制

吴杨娜，胡恭华

（1.赣南医学院2018级预防医学专业本科生；2.赣南医学院公共卫生与健康管理学院；3.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

细胞对DNA 损伤的反应统称为细胞损伤反应（DNA Damage Response，DDR）。 DDR 参与调节DNA 损伤识别、DNA 修复因子招募、DNA 修复途径的启动和协调、细胞周期转运和细胞凋亡的信号通路［1］。自噬是一个进化保存的过程，捕获异常细胞内的蛋白质或受损的细胞器，输送给溶酶体，其对维持细胞和机体平衡、衰老和多种病理反应有重要作用。在癌症发展过程中，自噬可能同时起到促进肿瘤发生和抑制肿瘤的作用［2］。而Beclin-1 是自噬的关键调节器，通过Beclin-1-Vps34-Vps15复合体参与自噬体的形成［3］，自噬是一种细胞自降解过程，已被证明与DNA损伤反应有关［4］。

1 Beclin-1的结构及其功能特性

1.1 编码Beclin-1 的BECN1 基因的染色体定位及其作用BECN1 是胚胎存活和正常发育的必需基因，在胚胎发育过程中发挥吞噬和清除凋亡细胞的作用［5］。Beclin-1 于1998年命名，由自噬相关基因——BECN1 编码。人类BECN1 基因位于染色体17q21.31 上，与酵母自噬基因Atg-6 高度同源。它是第一个被发现的哺乳动物自噬基因，同时被确定为单倍剂量不足的肿瘤抑制剂［6］。 BECN1 完整cDNA 编码2 098 bp的转录序列，包括120 bp的5'非编码区，1 353 bp 编码区和625 bp 的3'非编码区，编码与细胞凋亡抑制剂Bcl-2 相互作用的60 kD 卷曲螺旋蛋白。具有12个外显子，长度从61～794 bp，延伸可超过人类基因组12 kb。

有研究报道，在人类乳腺癌细胞系中，BECN1等位基因缺失比BECN1 突变的频率更高。在不同的癌细胞中发现了BECN1 的等位基因缺失和表达降低［7］。在翻译水平上，人乳腺上皮癌细胞和组织中BECN1 的表达降低，并将BECN1 诱导到人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）中，可抑制裸鼠的增殖、体外集落形成和肿瘤形成。研究发现BECN1促进了人乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞）中的细胞增殖和集落形成，可以在不同的细胞环境下作为癌基因或发挥抑癌作用［8］。此外，BECN1在自噬中也起着重要作用，该作用触发了一系列与自噬体形成有关的蛋白质。BECN1 的调节可发生在转录、翻译和翻译后修饰的水平。BECN1 的翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化和泛素化，这些对于自噬诱导至关重要，另外，BECN1 的泛素化会影响其蛋白质稳定性或功能。这些研究表明调节BECN1 的表达是自噬诱导中的重要事件［9］。

1.2 Beclin-1 的结构特点Beclin-1 是一种由450个氨基酸组成的60 kD 蛋白质。它有3个不同的结构域，包括Bcl-2（B-cell lymphoma/leukemia 2 gene，B细胞淋巴瘤/白血病2 基因）结合部Bcl-2 同源域3B（Bcl-2 homology-3，H3）、中央螺旋区（central coiled-coil domain，CCD）和进化保守结构域（evolutionarily conserved domain，ECD）。BH3（氨基酸105～130）结构域位于一个无序的N 端区域，与抗凋亡蛋白家族（Bcl-XL和Bcl-2）相互作用。CCD是一个包含氨基酸141～171的可弯曲螺旋结构域，其与紫外线辐照耐药相关基因（ultraviolet radiation resistance-associated gene ，UVRAG）编码的蛋白质结合，中央CCD 可产生一个不活跃的Beclin-1 同源二聚体。 Beclin-1 BH3 结构域与Bci-2/Bcl-XL 相互作用，这可能稳定CCD 介导的Beclin-1 二聚体，从而有效抑制自噬体的形成。第3个结构域ECD（氨基酸175～264），也被称为β-α 重复自噬特异性域（BARA；氨基酸265～450），与磷脂酰肌醇3-激酶-Ⅲ（phosphoinositide 3-kinase-Ⅲ，PI3K-Ⅲ）结合并参与细胞器脂质膜的结合。 ECD 结构域对于磷酸肌醇3- 激酶VPS34（phosphatidylinositol 3-kinase VPS34，PI3K VPS34）的募集至关重要，PI3K VPS34 不仅诱导自噬，还导致肿瘤抑制。此外，Beclin-1 还含有富含亮氨酸的氨基酸序列，负责有效的核输出信号（NES）［6］。人类许多组织表达的Beclin-1 主要位于胞质结构内，包括线粒体和核周膜。越来越多的证据表明，E2F转录因子（E2F）和核因子（NF）- κB 调节自噬中Beclin-1的表达。而且，Bcl-2/Bcl-XL—Beclin-1的相互作用可能受翻译后修饰的影响。例如，Beclin-1和Bcl-2 的磷酸化和泛素化可以稳定或解离它们的相互作用，这可能分别导致自噬的抑制或启动［10］。

1.3 Beclin-1 的功能特性Beclin-1 在机体中发挥重要作用。Becin-1是自噬的核心参与者，其翻译后修饰会影响其稳定性、相互作用和调节PI3K活性的能力，从而影响细胞调节自噬的能力。Beclin-1 的许多结构域通过改变其构象而参与介导多个交互作用分子之间的信息传递，从而使Beclin-1 成为调节PI3K 活性和自噬的重要分子平台［11］。Beclin-1是自噬相关蛋白，可以激活自噬，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是自噬的阴性靶标。mTOR 是PI3K 家族的成员，与大肠癌细胞的增殖、存活、侵袭和转移有关。细胞缺氧或能量缺乏可导致mTOR失活，从而促进自噬［12］。有研究报道Beclin-1 的同源性丧失导致胚胎细胞死亡，而Beclin-1 基因的异质性损失减少了不同细胞类型的自噬［13］，虽然自噬通常被认为是一种细胞保护机制，它也被称为Ⅱ型细胞死亡，细胞死亡的发生可能是由于过度自噬［14］。此外，自噬的抑制导致受损线粒体和氧化应激物质的积累，也会导致细胞死亡［15］。Beclin-1 是自噬的标志之一，在自噬中起着重要作用，它被认为是自噬的动态指标［16］。在自噬的启动过程中，Beclin-1 可以促进自噬体膜的成核，并促进吞噬体的延伸过程［17］。 有研究表明Beclin-1 过度表达抑制细胞活力并诱导细胞凋亡，Beclin-1 和Bcl-2 充当自噬和凋亡之间的开关，Bcl-2通过与Beclin-1 结合而证明可以抑制自噬。因此，促进Bcl-2 和Beclin-1 的结合可能是抑制自噬的一种机制，相反，Bcl-2与Beclin-1的分离对于激活自噬可能至关重要［18］。

近年来，Beclin-1的抗肿瘤效应越来越受到人们的关注。在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和其他肿瘤中已经发现了Beclin-1 基因缺失。Beclin-1 具有与抗凋亡蛋白Bcl-2结合的BH3结构域，从而破坏了肿瘤细胞的抗凋亡能力［19］。MATTHEW-ONABANJO AN等［20］证明了Beclin-1 通过调节细胞吞噬受体的运输及表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGFR）和转铁蛋白受体（Transferrin receptor1，TFR1）的降解来抑制肿瘤的增殖。当Beclin-1 表达水平降低时，EGFR 和TFR1促进肿瘤的增殖，EGFR 表达增强，下游ERK1/2 激活增加，这种增强的活性使肿瘤增殖对靶向该信号通路的药物更敏感。当Beclin-1 表达降低时，TFR1 的表达在肿瘤中也增加，并且该营养受体支持增强的肿瘤细胞增殖。Beclin-1 调节肿瘤生长和进程的一种机制是通过控制溶酶体运输，这在控制细胞表面受体功能的结果中起着重要作用。此外，Beclin-1 可能通过有丝分裂信号传导延迟细胞周期进程并增加G1期细胞的比例，从而导致肿瘤生长抑制［21］。

2 DNA损伤反应

DDR是一种保护机制，在保持DNA完整性方面起着至关重要的作用。作为遗传的基础，DNA 完整性对于编码蛋白质和维持正常的细胞功能至关重要。DNA 损伤（例如链断裂和碱基改变）将导致不完整的蛋白质形成，并导致受损的细胞形成。DNA易受内源性和外源性毒素的伤害，因此，细胞DDR已经发展为严格调控的信号传导途径，为细胞应对各种类型的DNA 损伤提供了途径［22］。细胞通过激发稳健的DNA 损伤反应途径对DNA 损伤作出反应，这为指定的DNA 修复途径留出足够的时间以依赖底物的方式物理去除损伤。机体内至少有5个主要的DNA 修复途径，包括碱基切除修复（Base Excision Repair，BER）、核苷酸切除修复（Nucleotide Excision Repair，NER）、错配修复（Mismatch Repair，MMR）、同源重组（Homologous Recombination，HR）和非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ），均活跃于不同阶段的细胞周期，使细胞修复DNA 损伤。此外，还有DNA 断裂修复，比如单链断裂修复（SSBR）和双链断裂修复（DSBR）［23］。启动DNA 损伤信号转导级联通路的关键分子是磷脂酰肌醇3激酶相关激酶（PIKK），其中包括共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）、共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白（ATR）以及DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-PK）［24］。它们是DNA 损伤反应过程中发挥重要作用的物质，它们可调节检查点，激活DNA 损伤反应。如果修复过程不正确，DNA 损伤会导致突变和染色体畸变，从而改变细胞行为并导致癌症［25］。

3 Beclin-1在DDR中的作用

在真核细胞中，DNA损伤触发复杂的DNA损伤反应网络，包括DNA 损伤的传感、DNA 修复因子的组装、细胞凋亡、细胞周期传递的逮捕以及DNA 修复的激活，以维护基因组的完整性［26］。

3.1 Beclin-1 与细胞凋亡的相关性凋亡是细胞内受到精确调控的死亡过程，它可以维持组织中细胞数量的平衡，并在免疫反应或细胞受损过程中起到防御的作用［27］。细胞凋亡的特征是细胞萎缩、染色质浓缩、核碎裂和质膜起泡［28］。凋亡可以通过细胞表面死亡受体的外在刺激或线粒体信号通路的内在刺激引起。外在通路由细胞表面死亡受体刺激和活化激活，而内在通路涉及线粒体和随后的caspase-9活化释放细胞色素c，caspase-8和caspase-9的激活可增强caspase-3 的激活［29］。大量证据表明，自噬可以基于多种机制抑制凋亡，包括增加自噬可以清除受损的线粒体或失活蛋白，也可通过自噬将未折叠的蛋白质隔离起来，这些蛋白质是内质网应激的引发剂，可减少细胞凋亡［30］。一旦半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspases 切割Beclin-1，使其C-终端裂解，将失去自噬诱导功能，获得凋亡诱导功能。Beclin-1的C-终端裂解片段可以从细胞质向线粒体转位，导致线粒体外膜渗透性变化，诱导细胞色素c的释放并激活caspase 级联反应，最终诱导凋亡。LI X等［31］研究发现Caspase 介导的Beclin1裂解抑制自噬并促进S1 诱导的人卵巢癌SKOV3 细胞凋亡。实验结果表明，与对照组相比，由S1诱导的Beclin-1裂解片段的表达在线粒体中增加，并且用泛半胱天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD 处理后，该表达降低。因此，活化的caspase 介导的Beclin-1 的裂解片段不仅失去其诱导自噬的功能，而且可能重新定位于线粒体，并促进S1 诱导的SKOV3 细胞凋亡。 此外，ZHANG W 等［32］研究表明锚蛋白重复序列和SOCS盒 蛋 白3（ankyrin repeat and SOCS box protein 3，ASB3）可以通过控制caspase-8 介导的Beclin-1 在肝癌细胞（HCC）中的裂解来调节细胞凋亡的线粒体途径。在ASB3 沉默的肝癌细胞中，Beclin-1 的C 端片段明显积累并主要定位在线粒体部分，Beclin-1 基因敲除阻止了细胞色素c 和细胞凋亡诱导因子（Apoptosis Inducing Factor，AIF）从线粒体释放到细胞质，这进一步支持了c 端Beclin1 诱导的线粒体损伤启动了ASB3沉默HCC细胞线粒体凋亡的观点。此外，Z-VAD阻止了ASB3 沉默HCC 细胞中Beclin-1 蛋白的裂解，并抑制了caspase-3、8、9和PARP的裂解。在ASB3 沉默细胞中Beclin-1 的断裂是由活化的caspases（特别是caspase-8 介导的）参与了ASB3 基因下调的肝癌细胞凋亡。 Beclin-1 的上游信号caspase-8 的激活被Beclin-1 的下调所抑制，二者相互协调了凋亡的激活。Beclin-1 和caspase-8 的断裂相互依赖，协调ASB3 基因敲除诱导的HCC 细胞线粒体凋亡。Beclin-1 诱导细胞凋亡的机制尚不清楚，上述发现仍需进一步证明。

3.2 Beclin1在细胞周期检查点的作用机制细胞周期检查点是真核细胞中的重要检查机制，通过监测细胞周期中的缺陷来精确调节细胞分裂。因此，检查点允许不受控制的细胞修复DNA 损伤或在DNA 损伤后阻断细胞分裂而死亡。尤其是ATM 和ATR 通过诱导检查点激酶1（Chk1）和激酶2（Chk2）的磷酸化，诱导细胞周期延迟，以应对遗传毒性应激，包括活性氧（ROS）和化学物质［33］。癌细胞失去细胞周期控制并显示出无限增殖，阻止细胞周期，尤其是在G2/M 检查点，而G2/M 期阻滞是DNA 损伤后的一种特殊现象，特别是在对电离辐射（IR）的回应。LIANG N等［34］证明了Beclin-1在红外诱导G2/M细胞周期阻滞和凋亡中的关键作用，Beclin-1 敲除可延迟IR 诱导的G2/M 期阻滞。此外，Tip60和ATM被确定为Beclin-1 的重要分子调节器。Tip60，也被称为KAT5，属于组蛋白乙酰基转移酶（HATs）的MYST 家族。Tip60 在许多细胞过程中发挥作用，包括染色质重塑、DNA 修复、基因转录、凋亡和肿瘤发生。免疫荧光结果显示，在IR 暴露之前，Tip60扩散到整个核质中，这与Beclin-1 的分布相似，Tip60 和Beclin-1 强烈共定位。 但是，在暴露于IR 之后，Beclin-1 从细胞核移位到核周区或细胞质，Tip60 则移位到核小体中。相反，IR 诱导Tip60 定位到核小体中。它们分布和相互作用的这种变化表明，Tip60可以通过Beclin-1 调节IR 诱导G2/M 期阻滞。据报道，在Beclin-1 T57 位点中发现了一个新的磷酸化位点，而Beclin-1 T57 可能是ATM 靶标的磷酸化位点，而T57 位点的功能在受到IR 照射后可能至关重要。此外，有数据表明自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3MA）明显延迟IR 引起的G2/M 阻滞，并且这种延迟不是由抑制ROS或阻止ATM 活性产生。因为3MA的目标是Beclin-1/PI3K-Ⅲ复合物，3MA 还 提 高了Beclin-1/PLK1 和Beclin-1/CDC25C 相互作用的水平，这表明Beclin-1 可能在IR 诱导的G2/M 期阻滞中发挥作用。有证据表明Beclin-1 可能参与有丝分裂或细胞周期进展，Beclin-1 通过与PLK1 和CDC25C 相互作用来调节细胞周期阻滞，参与IR诱导的G2/M期阻滞。

3.3 Beclin-1 与DNA损伤修复的关系尽管Beclin-1 主要被认为是胞质蛋白，但它也位于细胞核中，在细胞核中的存在及其向细胞质的转运与其自噬功能和DNA 损伤修复作用紧密相关。Beclin-1发生核质穿梭的先决条件是存在完整且功能正常的核输出信号。Beclin-1 在具有自噬功能的应激细胞中的核定位与DNA 双链断裂修复有关，可通过与DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 相互作用并将其招募至双链DNA 断裂（Double Strand Breaks，DSB）站点，从而启动DNA 损伤修复。HAVAKI S等［35］发现在喉癌发生的连续阶段中观察到的Beclin-1 在核中逐渐减少，可能反映了DNA 修复过程受损，可能加剧基因组不稳定。此外，XU F 等［36］研究证实Beclin-1 缺失降低了DNA 损伤修复蛋白的表达和DSB 修复途径相关的修复配合物的形成。一方面，红外照射可导致Beclin-1 的核定位瞬时增加，这表明Beclin-1 可能参与了DNA 对辐射的损伤反应的调节。在暴露于IR的敲除Beclin-1 的细胞中，DSBs 的生物标记物ser139 磷酸化组蛋白H2AX（phosphorylated H2AX，γ-H2AX）与野生型细胞相比显著增加，并且与野生型细胞相比，Beclin-1 敲除细胞在修复IR 诱导的DNA DSBs方面也具有较慢的动力学。同时，Beclin-1也参与HR 和NHEJ DSB 修复途径，而敲除Beclin-1可以明显减少修复DNA DSB 的途径。具体而言，与野生型细胞相比，Beclin-1敲除细胞通过NHEJ和HR途径的DNA DSB 修复分别降低了约60 倍和30 倍。敲除Beclin-1明显降低了DNA-PK复合物的形成，对MNR 复合物的形成有轻微影响，因此，Beclin-1可能通过促进DNA-PK复合物和MNR复合物的形成来部分调控DSBs 修复。另一方面，虽然过表达Beclin-1可以改善缺乏ATG7依赖性自噬细胞的DNA损伤修复，但当DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 耗尽时，Beclin-1 不能在细胞中做到这一点。由于Beclin-1 的过表达，增强的自噬作用部分可代替DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 在野生型细胞中的丧失，而不能在自噬缺陷型细胞中替换。在自噬完整的野生型细胞中，Beclin-1 的过表达增强自噬，进而改善DNA损伤修复。相反，自噬缺陷细胞中Beclin-1 的过表达不再恢复自噬能力，而Beclin-1对DNA损伤反应的缓解作用仅取决于其与DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 的相互作用。因此，当自噬和DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 都没有时，Beclin-1 无法改善DNA损伤修复。

除此之外，Beclin-1和UVRAG 调节了DNA 损伤修复，这些反应可能利用非同源末端连接修复辐照结肠直肠癌细胞中的DSB。研究发现Beclin-1 结合缺陷的UVRAG 突变体可以增加辐射诱导的DSB，UVRAG调节DNA损伤修复的能力取决于其Beclin-1交互域，若该结构不完整，不能结合Beclin-1，则其防御DSB 的能力将大幅度降低。 Beclin-1 和UVRAG 调节DNA 损伤修复和调节中心体数量的能力表明这些基因在维持基因组稳定性中起作用［37］。

4 展望

综上所述，Beclin-1 在DNA 损伤反应中起重要作用，其诱导细胞凋亡，参与细胞周期阻滞，调节DNA 损伤修复。Beclin-1 敲除可明显减少DNA 修复的途径，这增加了Beclin-1 在DNA 损伤反应调控中的重要性。而当细胞中DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 耗尽时，Beclin-1 不能调节DNA 损伤修复，这说明Beclin-1 与DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 相互作用才能调节DNA 损伤修复，而Beclin-1 是如何与DNA 拓扑异构酶Ⅱβ 相互作用的？是直接作用还是间接作用的？又是如何参与DNA 损伤反应的？这些问题都有待解决。大量的研究表明Beclin-1在DNA损伤反应中发挥重要作用，因此，深入阐明Beclin-1调控DNA损伤反应的作用机制是毒理学一个新的研究方向。