IGFBP-rP1、BDNF及TrkB在子宫内膜癌中的表达及临床意义

郑伟平 黎敏华

研究发现代谢综合征与子宫内膜癌关系密切，可使子宫内膜癌发病风险显著增加[1]，胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白（insulin like growth factor binding protein-related protein，IGFBP-rP）通过抑制胰岛素/胰岛素生长因子信号通路，参与子宫内膜癌的发病[2～4]。研究显示脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和酪氨酸受体激酶B（tropomysin related kinase B，TrkB）在多种肿瘤中高表达，许多信号通路参与BDNF/TrkB 信号途径对肿瘤发生调控作用[3～5]。IGFBP-rP1 和TrkB/BDNF通路的关系未知。本次研究探讨IGFBP-rP1、BDNF及TrkB 在子宫内膜癌中的表达，以及三者与子宫内膜癌临床病理特征的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016 年1月至2020 年1月绍兴市人民医院妇科收治的102例子宫内膜癌患者为实验组，年龄41～69岁，中位年龄52.00岁，其中内膜癌细胞分级：G1～G2 级81例、G3 级21例；手术病理分期（FIGO 2009）：Ⅰ～Ⅱ期81例、Ⅲ～Ⅳ期21例；9例患者出现淋巴结转移。纳入标准为：术前经诊刮术取得组织标本，经病理证实为子宫内膜癌，并在本院行子宫内膜癌分期术或减瘤术，术后病理再次证实为子宫内膜癌。排除标准为：既往恶性肿瘤病史，仅行诊刮术但未行分期术或减瘤术，术前接受过放疗或化疗，既往或正在使用免疫抑制剂。选择本院同期40例正常子宫内膜组织为对照组，年龄39～68岁，中位年龄51.00岁，所有手术切除标本均经术后常规病理检查。所有患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

1.2 组织芯片的制备 对每一组织标本，由高级病理医师复核再次确认病理诊断，镜下观察苏木精-伊红切片以确定所需组织部位。在4 cm×2 cm×1 cm 大小的空白蜡块内设计12×10 点组织列阵，用组织芯片仪打孔制成模块。用组织穿刺针从组织块逐个取出直径1 mm、高4 mm的组织柱，放入预先设计的阵列模块中，排成组织芯片。将制成的组织芯片面朝下放在铜板上，于55 ℃放置30 min，轻压模块使组织柱在模块中排平。对蜡块进行连续切片，裱于防脱载玻片上。观察组织芯片上组织点是否脱片、易位和皱折，并用苏木精-伊红染色进一步分析芯片制备情况。

1.3 试剂及方法 IGFBP-rP1 鼠抗人单克隆抗、BDNF 鼠抗人单克隆抗体、TrkB 兔抗人多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司，EnVision+System/HRP二抗和二氨基联苯胺显色试剂盒购自丹麦DAKO公司。采用Envison二步法进行免疫组化染色，操作步骤严格按照试剂盒说明。组织芯片4 μm连续切片，脱蜡，水化，枸橼酸盐缓冲液抗高温高压修复抗原，内源性过氧化物酶阻断，山羊血清中和，加入IGFBP-rP1、BDNF、TrkB 一抗，冰箱4 ℃孵育过夜，滴加Envision 复合物，显微镜下二氨基联苯胺显色，适时终止，苏木精-伊红复染，封片。用已知IGFBPrP1、BDNF、TrkB 阳性肝癌标本作为阳性对照，磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照。

1.4 结果判读 IGFBP-rP1 以细胞浆或细胞膜着色为阳性，BDNF 以细胞浆见着色为阳性，TrkB 以细胞浆或细胞膜着色为阳性。采用半定量法计分。随机选取5个高倍镜视野（×400）计数并取阳性细胞平均数，1分：阳性细胞百分比1%～10%，2分：11%～50%为，3分：51%～75%，4分：＞75%。根据着色程度计分：0分：未着色，1分：淡黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色。两者乘积≥3分为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 数据包进行统计学分析。计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGFBP-rP1、BDNF、TrkB 在子宫内膜癌和正常子宫内膜中的表达见图1、图2

由图1 可见，在子宫内膜癌中IGFBP-rP1呈强阳性表达，深染，主要表达在细胞浆；BDNF 呈强阳性，主要表达在细胞浆和细胞膜；TrkB 阳性表达位于细胞浆或细胞膜，阳性细胞多成灶状或团状分布。由图2 可见，在正常子宫内膜中的IGFBP-rP1 阴性表达，BDNF 呈弱强阳性，TrkB 呈强阳性表达。

图1 IGFBP-rP1、BDNF、TrkB在子宫内膜癌中的表达示意图（免疫组化染色，×200倍）

图2 IGFBP-rP1、BDNF、TrkB在正常子宫内膜中的表达示意图（免疫组化染色，×200倍）

2.2 IGFBP-rP1、BDNF、TrkB 在子宫内膜癌和正常子宫内膜中的表达情况见表1

表1 IGFBP-rP1、BDNF、TrkB在子宫内膜癌中和正常子宫内膜中的表达情况/例（%）

由表1 可见，IGFBP-rP1、BDNF 及TrkB 在子宫内膜癌中的阳性表达率均高于在正常子宫内膜组织中的阳性表达率，差异均有统计学意义（χ2分别=15.74、6.69、11.93，P均＜0.05）。

2.3 IGFBP-rP1、BDNF、TrkB 的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系见表2

表2 子宫内膜癌中IGFBP-rP1、BDNF、TrkB的表达与临床病理特征间的关系/例（%）

由表2可见，IGFBP-rP1、BDNF和TrkB的阳性表达均与子宫内膜癌临床分期、细胞分级有关（χ2分别=4.03、4.51、5.31、5.06、6.30、7.81，P均＜0.05）；IGFBP-rP1 在淋巴结转移组中表达率高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（χ2=3.88，P＜0.05）；BDNF 和TrkB 在淋巴结转移组和无淋巴结转移组中表达差异无统计学意义（χ2分别＝2.85、2.59，P均＞0.05）。

2.4 相关性结果 相关分析结果显示子宫内膜癌中BDNF 的阳性表达与TrkB 阳性表达呈正相关（r=0.42，P＜0.05）。子宫内膜癌中IGFBP-rP1的阳性表达与BDNF 的阳性表达呈正相关（r=0.52，P＜0.05）。子宫内膜癌中IGFBP-rP1 的阳性表达与TrkB 的阳性表达呈正相关（r=0.58，P＜0.05）。

3 讨论

越来越多的研究证据表明，胰岛素抵抗是子宫内膜癌发病的危险因素[4]，IGFBP-rP1 通过与胰岛素/IGFs 结合后抑制胰岛素/IGF 信号通路，进而影响肿瘤细胞的生物学功能。IGFBP-rP1 在肿瘤中的作用存有争议，在众多恶性肿瘤中表达降低，抑制癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，表现出抑癌作用。但某些恶性肿瘤组织中IGFBP-rP1 呈现过度表达，可能起到促肿瘤作用[5,6]。本次研究发现，IGFBP-rP1 在子宫内膜癌中的表达明显高于正常子宫内膜，还与临床分期、肿瘤细胞分级、淋巴结转移有关（P均＜0.05），提示IGFBP-rP1 过表达促进子宫内膜癌细胞的增殖、浸润和转移，提示IGFBP-rP1可能与子宫内膜癌的发生有关。与Qin 等[6]和郭瑞霞等[7]报道大致相同。

许多信号通路参与BDNF/TrkB 信号途径对肿瘤发生和发展的调控作用。研究发现BDNF、TrkB的表达与子宫内膜癌细胞分化程度、临床病理分期、肌层浸润深度、淋巴结转移均显著相关，并且BDNF 与TrkB 的表达具有显著相关性，提示BDNF及TrkB 在子宫内膜癌的发生、发展中起重要作用，且两者相互促进[8～10]。本次研究发现，TrkB 在子宫内膜癌的表达高于正常子宫内膜，TrkB 表达随着肿瘤分化程度降低和临床分期升高（P均＜0.05），提示TrkB 的高表达与子宫内膜癌的发生、发展有关。TrkB 是神经营养因子BDNF 的特异性受体，TrkB 与BDNF 结合后激活其下游信号通路，抑制肿瘤细胞失巢凋亡并促进肿瘤细胞的迁徙、黏附、新生血管的形成等，进而促进肿瘤的侵袭和浸润[11,12]。本次研究发现，TrkB 阳性表达与BDNF 阳性表达呈正相关（P＜0.05），说明二者协同参与子宫内膜癌的发生，相互促进子宫内膜的进展。

研究发现IGFBP-rP1通过N末端结构域结合胰岛素生长因子，胰岛素生长因子1 和BDNF 分别与其相应受体结合后，二者协同起到保护神经和营养神经的作用，此外，胰岛素生长因子1 不仅上调BDNF 活性，促进其分泌[12,13]，而且促进TrkB 的分泌进而保护神经，并激活信号通路丝裂原活化蛋白激酶或磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶。研究发现TrkB 与BDNF 结合后主要激活三个信号通路，与细胞增殖及肿瘤发生密切相关，包括丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶和磷脂酶C途径[11]。本次研究结果发现，IGFBP-rP1阳性表达与BDNF、TrkB 阳性表达均呈正相关（P均＜0.05）。提示IGFBP-rP1 与BDNF/TrkB 可能通过激活或抑制相同的信号通路影响肿瘤细胞的生物学功能。

综上所述，IGFBP-rP1 通过BDNF/TrkB 信号通路参与子宫内膜癌的发生发展，进而影响肿瘤细胞的生物学功能。本次研究不足之处在于未进行分子水平实验和动物模型实验，故三者具体参与机制仍需要进一步研究。