宏基因组二代测序在肺部感染患者病原微生物检测中的应用价值分析▲

李殷康 黎雨 李文涛 柳广南

广西医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，南宁市 530007

感染性疾病是导致人类死亡的重要原因之一，其中肺部感染患者因其起病急、并发症多、病情重、病死率较高近年来需要在重症监护病房住院治疗的各年龄段患者数量在全球范围内均大幅增加[1]。正确认识感染病原体的种类可以帮助临床医生针对性地使用抗生素控制患者的肺部感染，从而改善患者的预后和生存质量。目前，对感染性疾病常用的检测方法有常规微生物培养及聚合酶链反应等，但这些方法的灵敏度和特异度有限，已不能满足临床诊断的需要[2]。宏基因组测序技术为Handelsman等[3]提出的一项新技术，可对样本提取到的所有微生物的遗传序列进行检测，并将检测得到的遗传序列与数据库中的病原菌特异性基因序列比对从而确定病原体的种类，该技术目前已经成为检测病原微生物的一种新兴方法。本研究对我科收治的60例肺部感染患者的肺泡灌洗液进行了宏基因组二代测序(mNGS)检测，并与常规涂片+培养的病原菌检测方法进行了比较分析，旨为肺部感染患者的病原体诊断增添新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年8月至2020年5月广西医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科收治的肺部感染患者60例作为研究对象。纳入标准：(1)符合美国胸科协会关于肺部感染的相关诊断标准；(2)肺部听诊可闻及啰音；(3)病情危重需要尽快明确肺部感染病原体；(4)特殊疾病患者如免疫抑制、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者等，需要尽快明确肺部感染病原体；(5)传统微生物检测技术反复检测结果均为阴性且治疗效果不佳；(6)临床怀疑为RNA病毒感染，如流感病毒感染等所致；(7)疑似某种特殊病原体感染；(8)长期发热和(/或)伴有其他临床症状、病因不明的肺部感染[4]；(9)患者或其家属签署检测研究知情同意书。纳入研究的60例患者中，男41例、女19例；年龄19～83岁，平均(51.5±16.0)岁。

1.2 方法

1.2.1 纤支镜检查前准备 检查前1天嘱患者睡前使用益口含漱液清洁口腔，5 mL/次，重复3次，含漱时间2～3 min/次，最后用无菌生理盐水100 mL清洁。患者检查日晨起后禁食禁饮，再次使用益口含漱液清洁口腔，5 mL/次，重复3次，含漱时间2～3 min/次，最后用无菌生理盐水100 mL清洁。益口含漱液的主要成分为三氯羟基二苯醚，是一种高效广谱抗菌剂，可以有效抑制口腔细菌滋生，防止口腔定植菌随唾液流入气道内引起标本污染，常用于危重症患者的口腔护理[4]。

1.2.2 标本采集 推送Olympus P260纤维支气管镜前端至CT影像提示病变的支气管亚段，使用37℃无菌生理盐水100 mL进行肺泡灌洗，回抽肺泡灌洗液，回抽的肺泡灌洗液不少于30 mL视为标本合格[5]，将所得肺泡灌洗液平均分装入2个无菌容器后分别送检。

1.2.3 病原体检测 (1)mNGS检测：采用美国illumina高通量测序技术对样本中的微生物DNA遗传序列进行宏基因组分析，将去除背景污染菌后得到的微生物遗传序列与数据库中微生物特异性核酸序列进行比对，并结合患者的临床表现，对患者肺部感染的病原体进行鉴定。(2)常规涂片+培养：采用美国BD公司生产的全自动快速生物质谱检测系统microfiex LT/SH联合镜下形态观察对患者肺部感染的病原菌进行鉴定。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0统计学软件分析数据。计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病原体检出情况比较 纳入研究的60例患者中，进行mNGS检测，检出病原微生物的患者共50例；进行常规涂片+培养检测，检出病原微生物的患者共14例。见表1。

表1 60例患者的mNGS检测与常规涂片+培养检测的病原微生物检出结果 (n)

2.2 mNGS与常规涂片+培养检测的各种病原微生物检出率比较 纳入研究的60例患者中，进行mNGS检测，检出病原微生物的患者共50例，检出率为83.33%；进行常规涂片+培养检测，检出病原微生物的患者共14例，检出率为23.33%。对肺部感染患者，进行mNGS检测的病原微生物总检出率显著高于进行常规涂片+培养检测，差异有统计学意义(P<0.05)；两种检测方法的各种病原微生物检出率比较详见表2。

表2 mNGS与常规涂片+培养检测的各种病原微生物检出率比较 [ n(%)]

3 讨 论

目前对细菌、真菌和病毒导致的感染性疾病进行诊断，主要是以采取标本培养等手段从而获得并对病原体作出鉴定作为“金标准”，但这些方法存在以下几个缺点：(1)常规标本培养耗时较长，通常为72 h左右，结核杆菌的培养时间更是长达2～6周甚至8周；(2)目前通过常规培养获得的病原体种类非常有限，常规培养基对于苛养菌的培养难以成功，对苛养菌进行培养需要加入特定的营养物质[6]；(3)常规微生物培养阳性率仅为13.79%～17.39%[7]；(4)存在标本保存、转运、检测过程等诸多环节，易造成标本污染而出现假阳性。但对于基层医疗单位而言，尽管常规微生物培养的阳性率低，目前仍然是一种不可或缺的检测手段。

mNGS可对提取到的样本中的所有微生物的遗传序列进行检测，并与数据库中的病原菌特异性基因序列进行对比，最后鉴定出一系列可能的感染菌群。mNGS可检测的对象包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体及寄生虫等，对罕见的病原菌感染的判断较常规培养检测具有突出的优势。

本研究结果显示，细菌是肺部感染患者的主要病原体，但常规涂片+培养对细菌的检出率较低，对结核分枝杆菌更是难以检出；常规涂片+培养对肺部感染患者的病毒、真菌以及分枝杆菌的检出率均显著低于mNGS。Shah等[8]认为，在呼吸系统感染中，病毒感染一直未得到足够重视，是因为现有的检测手段极少、技术滞后。抗生素的滥用、耐药菌的出现、检验手段更新慢、抗菌药物研发滞后导致对肺部感染患者的诊治变得愈发艰难。我国当今已经成为世界抗生素的生产大国和消费大国之一，抗生素的滥用导致耐药性从最初的单一耐药逐步演变为多重耐药，毒力强耐药菌的产生无疑会显著增加临床医生的工作难度，严重影响患者的预后及生存质量[9-10]。美国马里兰大学帕克学院为进一步认识耐药菌及其相关信息，创建了抗生素耐药性基因数据库，目前该库收录的耐药菌已多达380余种[11]。事实证明，仅靠常规的涂片与培养技术诊断病原菌已经难以满足现代医学诊疗的需要，而mNGS检测能凭借其先进的技术，通过对样本中病原体的核酸进行检测，无需培养便可以快速检出病原菌，具有快速、准确、覆盖范围广泛等突出优势，无疑给多重感染的诊断提供了新的手段，同时还可以进一步完善微生物的耐药基因和毒力检测，为临床医生针对性用药提供重要依据[12]。

2019年末暴发的新型冠状病毒肺炎如今已在全世界蔓延，国家卫生健康委员会发布的诊疗方案(试行第六版)诊断标准中再次肯定了病毒基因核酸测序和COVID-19高度同源即可确诊的诊断标准，这项诊断标准得到了中外学者的认可[13-14]。但是，历经多年的发展后虽然mNGS的检测费用已较以前明显降低，但仍然远高于常规涂片+培养的检测费用，因此目前难以作为普通检测项目进行推广普及。随着检测技术的不断进步以及多检测平台的竞争发展，相应的检测费用会逐步下降，届时二代测序技术将得以推广应用，更好地为患者提供服务。