阿帕替尼对胃癌细胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影响研究▲

宋锦添 陈奕贵* 郑亮 蔡雄超 王益

福建医科大学附属肿瘤医院&福建省肿瘤医院，1 腹部肿瘤内科，2 腹部肿瘤外科，福州市 350014

胃癌，仅次于肺癌，是全球第2大癌症死亡原因[1]。胃癌患者被确诊时通常已处于晚期，多已发生远处转移，预后较差，中位生存期约为10～12个月[2]。临床上治疗晚期胃癌患者最常用的化疗药物是人表皮生长因子受体2(HER2)靶向药物，但该类药物具有很强的细胞毒性，患者恶心呕吐、骨髓抑制和脱发等副作用严重[3]。肿瘤血管生成在肿瘤发生过程中的作用越来越受到人们的关注[4]。血管内皮生长因子(VEGFs)是血管形成过程中的关键调节因子，与受体酪氨酸激酶(RTK)结合后称为VEGFR1-R3[5-6]。血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)可以作为靶向位点用于癌症治疗药物的研发[7-10]。阿帕替尼是我国自主研发的一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，可以特异性与细胞内VEGFR2的ATP结合位点结合，阻断下游信号转导，抑制肿瘤新生血管的生成[11]。阿帕替尼有抗多种实体瘤的作用，包括肝细胞癌、非小细胞肺癌和晚期卵巢癌等[12-15]。在我国进行的胃癌Ⅱ期临床研究结果显示，阿帕替尼是一种治疗胃癌的有效药物[16]。为探讨阿帕替尼治疗胃癌的作用机制，本研究就阿帕替尼对胃癌细胞增殖、凋亡和VEGFR通路的影响进行了研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 胃癌细胞系HGC-27(货号：TCHu 22)和NCI-N87(货号：SCSP-534)购自中国科学院细胞库(上海)，将其置于10% FBS的RPMI-1640培养基(Gibco，货号：31800022)中，在37℃、5% CO2的环境下培养。收集第3代对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，根据实验设计方案对细胞进行相应处理。称取50 mg阿帕替尼溶于二甲基亚砜(DMSO) 1 mL后放入-20 ℃冰箱保存，使用时用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。

1.2 CCK-8细胞增殖试验 使用Cell Counting Kit-8试剂盒(上海Beyotime)检测细胞增殖情况。对NCI-N87和HGC-27细胞分别设置对照组及加药组(10 μM组，20 μM组，30 μM组，40 μM组，50 μM组)，每组设5个复孔。加药组细胞给予不同浓度的阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)处理，对照组细胞加相同体积的培养基，培养48 h后向每个孔中迅速加入10 μL CCK-8， 37 ℃孵育2 h后使用酶标仪(Bio-Rad，CA，USA)检测每个孔450 nm处的吸光度。

1.3 克隆形成实验 取对数生长期的NCI-N87和HGC-27细胞，常规离心收集，设对照组及加药组，将细胞接种到6孔板(每孔1×103)中， 37℃、5%CO2的环境下培养24 h。对照组细胞给予1‰ DMSO处理，加药组细胞分别给予10 μM、20 μM阿帕替尼处理，37℃、5% CO2的环境下培养2周。细胞集落用4%多聚甲醛固定30 min，之后用0.5%结晶紫染色30 min。用无菌水洗去染液，Odyssey扫描拍照，使用ImageJ软件计算细胞克隆数。

1.4 流式细胞检测 取对数生长期的NCI-N87和HGC-27细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，分为对照组和阿帕替尼处理组。对照组细胞给予1‰DMSO处理，阿帕替尼处理组细胞分别给予10 μM、20 μM阿帕替尼处理。48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并收集，用FITC-Annexin V/PI试剂(Roche，Basel，Switzerland)对细胞进行染色，用流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，USA)检测凋亡细胞情况。

1.5 Western blot NCI-N87及HGC-27细胞给予10 μM和20 μM阿帕替尼处理，分组。对照组细胞给予1‰ DMSO处理，48 h后收集细胞于1.5 mL EP管中，使用SDS裂解液裂解细胞，使用BCA分析试剂盒(Bio-Rad，Hercules，美国)测量蛋白质浓度。10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上，室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h，放入预先配好的Bcl-2(ab32124，1 ∶1000)、Bax(ab32503，1 ∶1 000)、Caspase 3(ab13847，1 ∶500)、Cleaved-Caspase 3(ab2302，1 ∶500)和内参β-Actin(ab8227，1 ∶1 000)的一抗缓冲液中4℃孵育过夜。用TBST洗涤30 min后室温孵育二抗IgG H&L(ab6721，1 ∶3 000)1 h，用TBST缓冲液洗涤30 min。使用增强的化学发光检测系统(Thermo Fisher Scientific)检测条带灰度值。

采用膜蛋白抽提试剂盒(货号：444810，Sigma-Aldrich，Darmstadt，Germany)检测VEGFR2蛋白水平，根据试剂盒说明书进行操作。一抗选择VEGFR2(ab134191，1 ∶1 000)，二抗选择IgG H&L(ab6721，1 ∶3000)，内参选择NaK ATPase(ab58475，1 ∶500)。抗体均购自Abcam(上海，中国)，一抗均为兔抗，二抗均为山羊抗兔。使用增强的化学发光检测系统(Thermo Fisher Scientific)检测条带灰度值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，两组间均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阿帕替尼抑制胃癌细胞的增殖 用不同浓度阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)分别处理NCI-N87及HGC-27细胞48 h，NCI-N87、HGC-27细胞存活率随着阿帕替尼浓度增高而降低，见图1A。根据48 h时的IC50值(图1B)选用10 μM和20 μM的阿帕替尼进行后续实验。分别用10 μM和20 μM的阿帕替尼处理NCI-N87及HGC-27细胞2周，随着阿帕替尼浓度的增高，NCI-N87及HGC-27细胞克隆数逐渐下降(图1C)。

图1 阿帕替尼抑制胃癌细胞增殖情况

2.2 阿帕替尼诱导胃癌细胞凋亡 流式细胞检测结果显示，随着阿帕替尼浓度的增加，NCI-N87及HGC-27细胞凋亡率显著增加，见图2A。Western blotting结果显示，随着阿帕替尼浓度的增加，NCI-N87及HGC-27细胞的Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高， Cleaved-Caspase3表达水平升高，见图2B。

图2 阿帕替尼诱导胃癌细胞凋亡情况

2.3 阿帕替尼对胃癌细胞VEGFR通路的影响 Western blotting结果显示，随着阿帕替尼浓度升高，NCI-N87及HGC-27细胞的VEGFR2蛋白表达水平均下降，见图3。

图3 Western blot检测VEGFR2蛋白表达水平

3 讨 论

胃癌是世界范围内最常见的癌症之一，晚期胃癌患者病情进展迅速、预后极差，一直是临床治疗的难题[17]。我国自主研发的阿帕替尼在胃癌患者的临床治疗中表现出具有显著的疗效[18]。为深入探讨阿帕替尼治疗胃癌的作用机制，本研究就阿帕替尼对胃癌细胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影响进行了研究。

细胞增殖与肿瘤性疾病的发生发展密切相关[19]。本研究结果显示，NCI-N87、HGC-27细胞的存活率、细胞克隆数随着阿帕替尼浓度的增高而降低，提示阿帕替尼具有抑制胃癌细胞增殖的作用。细胞凋亡在调节细胞存活和维持其稳态中具有重要意义，目前有很多药物是通过促进细胞凋亡来实现其抗癌作用，如长春新碱即是通过阻滞细胞的有丝分裂进而导致细胞凋亡而达到治疗癌症的目的[20-21]。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，具有明显的抑制细胞凋亡的作用；而Bax是一种促凋亡蛋白，可以促进细胞凋亡。当细胞凋亡启动时，Caspase 3会转变为有活性的 Cleaved-Caspase 3，参与细胞凋亡过程。本研究结果显示，随着阿帕替尼浓度的增加，NCI-N87及HGC-27细胞凋亡率显著增加，Bcl-2表达水平降低，Bax、Cleaved-Caspase3表达水平升高，提示阿帕替尼可促进胃癌细胞凋亡。VEGFR是血管内皮生长因子受体，对肿瘤细胞的血管生成有重要作用[22]。本研究结果显示，随着阿帕替尼浓度的升高，NCI-N87及HGC-27细胞的VEGFR2蛋白表达水平下降，提示阿帕替尼对胃癌细胞VEGFR通路具有抑制作用，可阻断下游信号传导，从而抑制肿瘤新生血管的生长。

综上所述，阿帕替尼可抑制胃癌细胞增殖，同时具有促进胃癌细胞凋亡和抑制VEGFR通路的作用。