基于网络药理学研究黄芪治疗膜性肾病的作用机制

庞欣欣，彭紫凝，邢玉凤，石秀杰，张雅歌，韩佳瑞,*，王振涛,*

(1 河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)肾病科，郑州 450002；2 河南中医药大学第二临床医学院，郑州 450046)

膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是导致成人肾病综合征的主要病因之一[1]。MN约占原发性肾小球肾炎30%，且呈逐年上升趋势[2]。MN多见于40岁以上人群，主要临床表现为水肿、蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和高血压，少数伴有镜下血尿[3]。MN的病理特征为肾小球基底膜上皮侧免疫复合物沉积，伴有肾小球基底膜弥漫增厚[4]。目前，MN的发病机制尚未明确，主要治疗方法以控制血压、降低尿蛋白、纠正脂代谢紊乱、利尿消肿及免疫抑制治疗等为主[5]，但是仍有约30%患者进入终末期肾脏疾病，依赖肾透析[6]。

中医药在治疗MN上有独特的优势，已逐渐被国内外接受[5,7]。黄芪(Astragalus membranaceus)是治疗MN的中药之一，不仅可以大剂量单独应用，还可作为君药组方配伍使用治疗MN[8-9]。黄芪具有补气升阳、固表止汗、行水消肿等功效，有“补气诸药之最”之称。西医学研究证实黄芪能通过抗炎、抗氧化、改善肾小球滤过、调节免疫系统、改善水钠代谢等多方面缓解肾脏疾病[10]。本研究通过网络药理学的方法挖掘黄芪的有效成分及靶点，利用复杂的网络可视化技术，引入黄芪作用于MN的靶点，进行疾病-药物-分子-靶点互相作用的可视化分析，以及基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析，为黄芪治疗MN的中医机制研究提供依据。

1 方法

1.1 黄芪有效成分筛选

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[11]挖掘黄芪的化学成分，根据各个成分的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)，即ADME参数筛选有效成分，其中筛选条件为药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug like，DL)≥0.18。

1.2 黄芪的作用靶点和MN的相关靶点检索

以“Astragalus membranaceus”为关键词，筛选TCMSP数据库中黄芪有效成分作用靶点。以“membranous nephropathy”为关键词，筛选GeneCards、DrugBank、TTD、DisGeNET等数据库中与MN有关的靶点。

1.3 PPI网络构建和关键靶点筛选

蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)是数据挖掘的重要途径。STRING数据库可以预测蛋白质之间的相互作用关系并构建PPI网络。依据STRING数据库构建黄芪作用靶点与MN靶点的交集PPI网络并筛选核心靶点。筛选参数设置主要有：生物机体选择为人类，最低要求交互分数设置最高置信度为0.4。

1.4 黄芪治疗MN网络调控可视化

基于黄芪和MN的PPI靶点数据，筛选得到黄芪可作用于MN的有效成分，采用Cytoscape 3.7.2软件把这些数据制作成可视化网络图，其中“圆形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“边”表示不同成分与靶点之间的关系，挖掘其相互之间的作用关系。即得到黄芪治疗MN的疾病-药物-分子-靶点调控网络图。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)数据库对有效靶点进行注释，并挖掘黄芪化合物的靶点蛋白在基因功能中的作用，进行GO和KEGG富集分析[12]。GO分析是生物学领域中用于基因产物细胞功能、分子功能和生物功能分类的系统，可以通过DAVID工具进行GO富集分析。同时，应用DAVID工具对黄芪和MN交集蛋白靶标基因进行KEGG通路富集分析，得到黄芪治疗MN的主要作用通路。采用校正统计学超几何分布定量(P.adjust值)评估存在于各GO和KEGG注释中的蛋白生物学功能和通路富集情况的显著性，P.adjust值在图中颜色越红，则显著性越强。

2 结果

2.1 黄芪有效成分ADME分析

检索TCMSP数据库中黄芪的化学成分，按照OB≥30%和DL≥0.18条件筛选出20个黄芪入血活性成分，有良好的口服生物利用度和药物相似性。见表1。

表1 黄芪有效成分

2.2 黄芪作用靶点和MN相关靶点检索结果

通过TCMSP数据库查找到的20个有效成分中，只有15个有效成分具有相对应的靶点。对这15个有效成分进行靶点基因注释，删去重复靶点，得到180个药物靶点。在GeneCards、DrugBank、TTD、DisGeNET等数据库中筛选MN相关靶点，删除重复值，共得到3191个与MN相关的靶点。取黄芪和MN的有效靶点交集，得到121个共同靶基因。

2.3 黄芪-MN作用靶点PPI关系分析

采用STRING数据库对黄芪-MN的121个相互作用靶点进行PPI分析，隐藏离散节点，得到1456条PPI关系。见图1。取其中富集节点数目最多的前30个靶点，做柱状图，得到前30个黄芪-MN核心靶点。横轴为富集节点数目，纵轴为靶点基因名称。核心靶点主要有蛋白激酶、炎症因子、血管内皮生长因子、细胞凋亡相关因子等。见图2。

图2 黄芪治疗MN的核心作用靶点

2.4 黄芪治疗MN网络可视化分析

通过Cytoscape软件进行黄芪治疗MN的疾病-药物-分子-靶点互相作用的可视化分析。纳入上述PPI网络筛选的121个基因和分析筛选得到15个黄芪可用有效成分，同时在网络中加入疾病和药物使网络图更加直观。网络可视化图见图3。

2.5 黄芪治疗MN的机制分析

通过DAVID工具对黄芪和MN交集蛋白靶标基因进行GO分析，得到黄芪可治疗MN的作用靶点的生物学功能128种，综合分析后取前20种功能特性，得到黄芪有效成分靶点主要通过这些生物学功能特性治疗MN，如细胞因子受体结合性、受体配体活性、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ型特异性、细胞因子活性等。见图4。再采用DAVID工具进行KEGG信号通路分析，探索黄芪治疗MN信号通路28条，综合分析后取前20条信号通路。KEGG分析显示，黄芪治疗MN的有效靶点主要作用在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路、内分泌抵抗力(endocrine resistance)、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)信号通路等。见图5。其中气泡颜色越红，则校正P值越高，显著性越强；气泡越大，则该生物学功能或该通路富集的靶点越多。根据显著性和富集靶点数目进行综合分析得到MAPK信号通路为最关键的治疗通路，同时用红色表示黄芪靶点在该信号通路上具体作用点。见图6(所有结果均符合P.adjust<0.05)。

注：六边形代表黄芪，菱形代表MN，三角形代表黄芪15个有效作用成分，圆形代表黄芪作用于MN的121个靶点。其中A代表(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol；B代表9,10-dimethoxypter ocarpan-3-O-β-D-glucoside；C代表(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol；D代表1,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene图3 黄芪-MN-有效成分-靶点网络关系图

注：计数代表与该生物学功能相关的靶点数量，P.adjust表示显著性图4 黄芪治疗MN的相关生物学功能

注：计数代表与该通路相关的靶点数量，P.adjust表示显著性图5 黄芪治疗MN关键信号通路

注：红色表示黄芪在信号通路上的作用靶点(来源于KEGG PATHWAY数据库)图6 MAPK信号通路图

3 讨论

MN占原发性肾病综合征的20%～35%，是国内外常见的引起肾病综合征的病理类型之一[1]。近年来，MN患病率逐年上升，其发病机制复杂，临床治疗困难，虽然大多数MN患者患病后及时对症治疗，能够缓解部分临床症状，但是仍有近1/3的患者不可避免进入终末期肾脏疾病，最终依赖肾透析[6]。因此，仍需要探索新的干预手段缓解MN进展，其中中医药治疗方法优势明显。

MN在中医学中尚无直接对应的病名，依据其临床表现可划分为“水肿”“虚劳”等范畴[13]。在MN的发展过程中，多数医家认为MN属本虚标实证，病机以肾、脾、肺等脏腑功能失调为主，以肾虚为根本病位[14]。研究表明[15]，MN不同时期的病因病机不同，初期多为正虚邪实，后期则为脾肾阳虚，肾气虚，脾失健运，水湿泛溢于肌肤，发为水肿，精微不固则下泄为蛋白尿，故脾肾气虚为基本病机，贯穿始终。研究表明[16]，MN病机之本主要为脾肾气虚，瘀水互结。因此，MN的中医辨证与脾肾气虚密切相关，治疗当以补气为主。《中国药典》2020年版记载黄芪性甘，微温，归肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效，为补气之要药，功效符合MN的中医治则[17]。国内外研究证实黄芪为治疗MN的核心中药之一，能够缓解MN进展[8-9]。

目前，黄芪治疗MN的作用机制尚不完全清楚。如项协隆等[18]认为黄芪有效成分可以通过调控蛋白激酶R样内质网激酶通路抑制内质网应激，缓解膜性肾炎大鼠的肾损伤。Zheng等[19]发现黄芪成分能够改善足细胞形态及细胞骨架受损，抑制细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化，黄芪作用于MN的机制可能与其有效成分能够调节细胞骨架蛋白及相关通路来减轻足细胞损伤有关。

网络药理学具有与中医药学基本特点一致的整体性和系统性，注重药物与疾病之间的相互作用，能把传统中药与现代药理学良好衔接，弥补临床用药安全性监测的不足，能在理论层面探索药物对疾病的作用机制[20]。本研究应用网络药理学探索了黄芪作用于MN的潜在分子机制。研究分析黄芪治疗MN有效入血的活性成分及靶点，得到黄芪主要通过槲皮素(quercetin)、毛蕊异黄酮(calycosin)、山柰酚(kaempferol)、异鼠李素(isorhamnetin)等有效成分，作用在MN多个靶点，如蛋白激酶1(AKT1)、炎症因子白介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞凋亡相关因子CASP3等。有研究表明，AKT可能参与药物治疗MN过程，其作用机制可能与保持足细胞骨架及足突完整有关[21]；VEGF可能在MN的发病机制中具有双重调节作用[22]；药物抑制IL-6表达能缓解MN炎症反应进而保护肾脏[23]等。通过GO分析得到这些有效作用靶点主要通过细胞因子受体结合性、受体配体活性及细胞因子活性等生物学功能特性治疗MN。

为进一步探索黄芪治疗MN的作用机制，本研究针对黄芪-MN之间PPI关系的所有靶点进行KEGG关键通路富集分析，结果显示，黄芪治疗MN主要通过MAPK信号通路、HIF-1信号通路、内分泌抵抗力、RAS信号通路等。依据富集靶点及显著性分析得到黄芪治疗MN关键信号通路为MAPK信号通路。本研究中，黄芪主要作用于MAPK信号通路包含的p38、ERK、JNK三个亚族，行使不同功能。其中，p38是MAPK信号通路的主要分支之一，通过调控p38调节活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase,PRAK)等激活低分子量热休克蛋白27(HSP27)，参与细胞的炎症应激反应，与细胞增殖、凋亡等多种生物学特性密切相关[24]。JNK介导的通路可被细胞因子、氧化应激、生长因子等多因素激活，ERK可调控细胞的多种生理功能，在多种疾病中发挥重要作用等[25]。与本研究一致，Hong等[26]认为抑制MAPK信号通路中p38、JNK的表达能保护足细胞免受补体复合物诱导的损伤。研究证实[19]，黄芪提取物能通过减少补体膜攻击复合物诱导的JNK和ERK1/2的磷酸化来影响MAPK信号通路，恢复足细胞形态避免MN加重。因此，以MAPK信号通路针对MN靶向治疗有一定的优势，黄芪治疗MN的具体机制可通过该通路进行挖掘研究。

本研究仍存在不足之处：① 网络药理学研究是基于已有的中药活性成分数据库，可能存在尚未发现的黄芪有效成分，研究结果不够全面。② 研究预测的活性成分-靶点之间具有关联性，但是两者之间的具体调控关系及靶点在KEGG分析所得的通路中的调控作用依旧不明。③ 分析所得的结果需进行体内或体外实验验证，缺少黄芪治疗MN的多中心大样本随机对照的临床研究，本课题组后续将以此为研究基础，进行实验研究，也为广大研究人员提供思路，深入探索黄芪治疗MN的具体作用机制。

综上所述，本研究通过对黄芪治疗MN的网络药理学挖掘，得到黄芪主要通过槲皮素、毛蕊异黄酮、山柰酚等有效成分具体作用在MN的AKT1、IL-6、VEGFA等多靶点，其主要生物学功能特性为细胞因子受体结合性、受体配体活性及细胞因子活性等，作用的关键通路为MAPK信号通路。黄芪可能直接或间接参与调节炎症、细胞凋亡、氧化应激等作用机制影响MN。本研究为后续临床验证及深入基础研究提供了重要的参考依据。