乳糖酸修饰的黄芩苷自组装胶束载药系统的制备及体外评价

邵艳寻，郭切切，张舒迪，杨雅欣，龚法伍，刘占军

华北理工大学药学院，河北 唐山 063210

中医学家发现许多中药材能抑制和减轻化疗药物产生的不良反应，提高治疗效果[1-2]。黄芩苷（baicalin，BC）是黄芩的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化、镇静、降压、免疫抑制等药理作用[3-4]。研究[5-6]发现，黄芩苷主要影响肿瘤细胞内源性凋亡，通过多种信号通路影响B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）家族蛋白、细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9等蛋白表达，诱导肝癌细胞凋亡。黄芩苷虽有诸多优势，但其水溶性较差，生物利用度低[7]。目前已经开发了一系列载黄芩苷的纳米制剂，包括固体脂质纳米粒、磷脂复合物、共沉淀物、纳米乳[8-12]等，但存在工艺复杂、载药量低等问题。阿霉素（doxorubicin，DOX）是一种蒽环类拓扑异构酶抑制剂，可通过下调Bcl-2的蛋白表达以及诱导Wnt通路抑制剂的表达来诱导肝癌细胞凋亡。但是通过单独应用阿霉素，常会因为其较差的器官选择性而引起严重的毒副反应。目前，已有研究发现黄芩苷在肝癌、肺癌、乳腺癌等癌症的化疗中具有辅助治疗的作用，可以减轻不良反应，增强抗癌效果。

自组装胶束作为纳米药物载体，具有内核疏水外壳亲水的结构，能改善难溶性药物的溶解性并实现持续、缓慢的药物释放[13]。针对胶束增溶能力强、粒径小、循环时间长等优点[14-16]，可通过寻找合适的载体材料设计开发载黄芩苷和阿霉素胶束。O-羧甲基壳聚糖（O-carboxymethyl chitosan，OCMC）保留了壳聚糖骨架大量的活性氨基，可用于化学修饰进行改造[17-19]。由于骨架上同时具有氨基和羧基，在水介质中有两亲性聚电解质的特性，在骨架上通过疏水修饰可以获得具有pH值敏感的壳聚糖自组装胶束体系。例如将疏水性药物小分子偶联到OCMC骨架上构建自组装前药胶束[20]。

乳糖酸（lactobionic acid，LA）可被肝实质细胞膜上的ASGP-R受体特异性识别并通过内吞作用快速摄取[21-22]，将其修饰到骨架上会增强载体的靶向递送能力。因而本研究设计合成CMBC及LACMBC，并以LA-CMBC为载体制备负载阿霉素的自组装胶束，对其制剂学性质及体外抗肿瘤活性进行考察，以期实现协同效应，为中药与化疗药物的协同抗肝癌研究奠定基础。

1 材料与仪器

FTIR-8400S红外光谱分析仪，日本岛津公司；ZEN3690型激光粒度分析仪，英国Malvern仪器公司；F-320荧光分光光度计，天津港东科技股份有限公司；布鲁克600兆核磁共振波谱仪，德国布鲁克仪器公司；JEM-2800F型聚焦双束扫描电子显微镜（SEM），美国FEI仪器有限公司；Lambda 35紫外可见光分光光度计，珀金埃尔默仪器有限公司；iMark全自动酶标仪，美国Bio-Rad公司。

黄芩苷（质量分数＞90%，批号21967-41-9）、N-羟基琥珀酸亚胺（NHS，分析纯）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，分析纯）、乳糖酸（分析纯）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，分析纯）、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）、无水乙醇（分析纯）均购于阿拉丁有限公司；OCMC，脱乙酰度＞90%，浙江澳兴生物科技有限公司；盐酸阿霉素，分析纯，天津市福晨化学试剂厂；DMEM高糖培养基（Eallbio，批号NG190320EL）、胰酶（Eallbio，批号N190823CF）、四甲基偶氮唑蓝（MTT，Eallbio，批号190114）均购于北京中生奥邦生物科技有限公司；胎牛血清，天津康源生物技术有限公司；人肝癌细胞HepG2受赠于华北理工大学的齐亚娟教授实验室。

2 方法与结果

2.1 CMBC的合成

根据文献方法[13]利用EDC/NHS介导的酰胺化反应，将黄芩苷偶联到OCMC骨架上合成CMBC。称取（76～189 mg黄芩苷，0.2～0.5 mol OCMC）的黄芩苷溶解于DMF中，超声溶解水浴加热至60 ℃，加入相当于黄芩苷2倍物质的量的EDC和NHS进行活化，搅拌30 min即得黄芩苷NHS活性酯溶液。另称取200 mg OCMC溶于蒸馏水中，60 ℃搅拌溶解，加入等量的DMF稀释，搅拌均匀。然后逐滴加入上述制备的黄芩苷活性酯溶液，60 ℃反应4 h后室温下继续反应24 h。反应液用透析袋（相对分子质量8000～14 000）在蒸馏水介质中透析72 h，冻干即得CMBC。通过控制黄芩苷和OCMC的投料比，可以获得不同黄芩苷取代度的CMBC。

2.2 LA-CMBC的合成

称取76 mg（0.25 mol OCMC）的乳糖酸溶于5 mL蒸馏水中溶解，加入相当于乳糖酸2倍物质的量的EDC和NHS搅拌30 min使乳糖酸的羧基活化。另取冻干的CMBC溶于蒸馏水中，搅拌过夜，将活化后的乳糖酸逐滴加入到CMBC水溶液中，室温搅拌48 h后，反应液用透析袋在蒸馏水介质中透析48 h，冻干即得LA-CMBC。合成路线见图1。

图1 CMBC和LA-CMBC的合成过程Fig.1 Synthesis of CMBC and LA-CMBC

2.3 偶联物的表征及结果

2.3.1 核磁共振氢谱（1H-NMR）检测及结果 以氘代DMSO和D2O为溶剂，分别对黄芩苷、OCMC进行1H-NMR分析；以混合溶剂（D2O-氘代DMSO 1∶1）对CMBC和LA-CMBC进行1H-NMR分析。结果发现，图2中OCMC在δ3.29～4.00显示出糖环骨架质子较宽的吸收峰。δ2.00处的特征峰归属于N-乙酰葡萄糖胺上的甲基氢。相比于OCMC在δ6.75～8.00出现的新的吸收峰，归属于黄酮类母核上的氢，其中在δ6.11～7.40处是苯环上氢的吸收峰，证实了黄芩苷成功地偶联到了OCMC骨架上。图2显示乳糖酸偶联至CMBC之后，在δ3.34～4.32出现了许多新的小峰，归属于乳糖酸环上的亚甲基峰。

图2 OCMC、CMBC和LA-CMBC的1H-NMRFig.2 1H-NMR spectrum of OCMC, CMBC and LA-CMBC

2.3.2 红外光谱（IR）检测及结果 采用IR法对OCMC、CMBC和LA-CMBC进行表征。结果（图3）显示，OCMC在1602 cm-1的特征吸收谱带为酰胺II谱带，对应于伯氨基上N-H的弯曲振动，酰胺I谱带是C＝O的伸缩振动吸收峰，波数稍高（1650 cm-1），由于1602 cm-1处吸收峰较大，因此使得酰胺I谱带和酰胺II谱带的吸收峰区分并不明显，说明OCMC的脱乙酰化程度较高，活性氨基较多。产物CMBC与OCMC图谱相比，出现了2个区分明显的吸收峰，位于1602 cm-1的酰胺II谱带吸收峰强度明显降低，而位于1650 cm-1的酰胺I谱带吸收峰则相反的呈现增强趋势，说明形成了更多的酰胺键，使得黄芩苷与OCMC骨架偶联。终产物LACMBC与CMBC相比，位于1602 cm-1的酰胺II谱带吸收峰强度进一步降低，而酰胺I谱带进一步增强，因此同样证实乳糖酸也是通过酰胺键与OCMC骨架偶联的。

图3 OCMC、CMBC和LA-CMBC的IR图Fig.3 Infrared spectrum of OCMC, CMBC and LA-CMBC

2.3.3 CMBC取代度的测定及结果

（1）黄芩苷分析方法的建立：采用紫外分光光度法测定黄芩苷的取代度。以无水乙醇为溶剂，配制一定质量浓度的黄芩苷溶液，在200～600 nm进行紫外光谱扫描。取少量OCMC、CMBC水溶液，分别用无水乙醇稀释至适当质量浓度进行光谱扫描，结果见图4。

图4 黄芩苷、CMBC和OCMC的紫外扫描图谱Fig.4 UV scanning atlas of baicalin, CMBC and OCMC

可以看出，黄芩苷有2处明显吸收，最大吸收波长是278 nm。而OCMC在此范围内均无吸收，说明OCMC材料对黄芩苷的紫外吸收没有任何影响。而且，偶联物CMBC显示出了跟黄芩苷峰形一致的吸收。因此，可以确定将278 nm作为检测CMBC中黄芩苷含量的检测波长，且进一步证明了黄芩苷成功修饰到了OCMC骨架材料上。

（2）黄芩苷标准曲线建立：以无水乙醇为溶剂，配制质量浓度分别为4.10、5.13、6.15、7.18、8.20、9.23 μg/mL的黄芩苷系列标准溶液，于278 nm处测定各吸光度值。回归方程为Y＝0.074 1X－0.043 3，r²＝0.997 4。

（3）黄芩苷取代度的测定结果：黄芩苷的取代度规定为每100个OCMC重复单元中氨基连接黄芩苷的个数。在CMBC合成中，通过控制黄芩苷和OCMC的投料比可以得到不同取代度的CMBC，即CMBC-1、CMBC-2、CMBC-3。称取3种CMBC各1 mg至5 mL量瓶中，无水乙醇溶解定容，分别在278 nm下测定吸光度，计算取代度。

取代度＝mMOCMC/(m样品－m)M黄芩苷

m指通过黄芩苷标准曲线计算出的CMBC偶联物中黄芩苷的质量，M黄芩苷指黄芩苷的相对分子质量；m样品指加入的CMBC总质量，MOCMC指OCMC单位糖单元的摩尔分数

从表1中看出，在黄芩苷投料比达到0.35时，已经有足够多的黄芩苷偶联到了OCMC上。因此，在偶联乳糖酸时为了能有较多的乳糖酸偶联到CMBC产物上，选用CMBC-2用于乳糖酸的接枝。

表1 黄芩苷和OCMC投料比及黄芩苷的取代度 ( ,n = 3)Table 1 Feeding ratio of baicalin and OCMC and substitution degree of BC ( , n = 3)

表1 黄芩苷和OCMC投料比及黄芩苷的取代度 ( ,n = 3)Table 1 Feeding ratio of baicalin and OCMC and substitution degree of BC ( , n = 3)

样品 黄芩苷与OCMC物质的量比 取代度/%CMBC-1 0.20∶1 8.3±0.8 CMBC-2 0.35∶1 12.5±1.1 CMBC-3 0.50∶1 14.2±1.6

2.4 自组装胶束的制备及表征

采用透析-超声法制备自组装胶束。由于CMBC和LA-CMBC均为两亲性偶联物，所以两者在水中透析的过程中就会自组装形成纳米胶束，为了使纳米颗粒分散均匀，再用探头式超声在冰浴条件下超声处理3次，每次处理2 min，超声程序设置为开2 s停4 s，超声功率为120 W。然后过0.45 μm的滤膜，即得自组装胶束（图5），于4 ℃冰箱保存。

图5 CMBC胶束 (左)、LA-CMBC胶束 (中) 和LACMBC冻干物 (右)Fig.5 CMBC micelles (left), LA-CMBC micelles (middle),and LA-CMBC lyophilized products (right)

采用激光粒度电位分析仪测定胶束的粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI）和Zeta电位，结果见表2和图6。采用SEM观察胶束的形貌大小，结果见图7。

图6 CMBC-2 (A)、LA-CMBC-2 (B) 的粒径分布 (I) 和Zeta电位 (II)Fig.6 Particle size distribution (I) and Zeta potential (II) of CMBC-2 (A) and LA-CMBC-2 (B)

图7 CMBC-2 (A)、LA-CMBC-2 (B) 的扫描电镜图Fig.7 SEM images of CMBC-2 (A) and LA-CMBC-2 (B)

表2 3种不同取代度的CMBC和LA-CMBC的粒径、PDI和Zeta电位 ( , n = 3)Table 2 Partical size, PDI and Zeta potential of CMBC and LA-CMBC with three different degree of substitution( , n = 3)

表2 3种不同取代度的CMBC和LA-CMBC的粒径、PDI和Zeta电位 ( , n = 3)Table 2 Partical size, PDI and Zeta potential of CMBC and LA-CMBC with three different degree of substitution( , n = 3)

样品 取代度/%粒径/nm PDI Zeta电位/mV CMBC-1 8.3 215.0±4.8 0.112±0.030 -17.02±0.29 CMBC-2 12.5 181.1±3.7 0.094±0.021 -17.16±0.75 CMBC-3 14.2 164.7±6.5 0.163±0.035 -17.24±0.82 LA-CMBC-2 - 156.3±6.4 0.131±0.087 -14.47±0.51

3种CMBC胶束粒径在164～215 nm，随着黄芩苷取代度的增加，胶束粒径逐渐减小。这是因为疏水基团越多，形成的疏水性内核就更紧密，粒径更小。LA-CMBC-2胶束粒径约为156 nm，可以满足肝靶向制剂要求，粒径小于CMBC-2胶束，推测可能是水溶性乳糖酸的引入使OCMC骨架柔性增强，更易弯曲缠绕成粒径更小的粒子。2自组装体系均显示出负值的Zeta电位，说明在自组装的过程中，带负电荷的亲水性OCMC可以较为均匀的分布在偶联物的表面，也间接证实了自组装体系的形成。通过SEM观察到的自组装胶束为形状较规则的类球形，粒径大小较均一，实际观察到的粒径约为150 nm，比粒度电位分析仪测定的粒径稍小。这是因为SEM样品在预处理过程中因干燥导致粒子失水，从而使电镜下呈现的粒径比其在粒度仪（水介质体系）中的数据要稍小一些，此现象与文献报道一致[23]。

2.5 临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）的测定及结果

LA-CMBC在水中的自组装行为采用芘荧光探针法进行考察。配制质量浓度为0.012 mg/mL的芘溶液和1 mg/mL的LA-CMBC母液。取8个棕色样品瓶，各加入100 μL芘溶液，氮气吹干后各加入不同体积的LA-CMBC母液，蒸馏水定容至10 mL。使所配制的系列溶液质量浓度分别为0.001、0.005、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 mg/mL。水浴超声40 min，室温避光静置8 h。荧光分光光度计的激发波长为334 nm，测定各溶液中芘的荧光吸收，将芘的第3个峰的谱带强度与第1个峰的谱带强度之比（I3/I1）对质量浓度的对数做图，交点处对应的质量浓度即为胶束的CMC值。

测得LA-CMBC胶束的CMC值为（0.081±0.019）mg/mL（图8），说明LA-CMBC在水中容易聚集形成纳米粒，并且进入血管后可以抵抗大量的血液稀释，是一种良好的两亲性偶联物。

图8 芘发射光谱荧光强度比值I3/I1和胶束质量浓度（C）的对数关系图 ( , n = 3)Fig.8 Logarithmic relationship between pyrene emission spectral fluorescence intensity ratio I3/I1 and micelle concentration ( , n = 3)

2.6 载药胶束DOX/LA-CMBC的制备、含量测定、体外释放及结果

2.6.1 载药胶束的制备 采用透析法制备DOX/LA-CMBC胶束。称取DOX·HCl 3 mg溶于5 mL DMSO，加入2倍物质的量的三乙胺进行脱盐酸处理，避光搅拌过夜。另取LA-CMBC 10 mg溶于5 mL蒸馏水，搅拌过夜使之充分溶胀溶解。将阿霉素溶液缓慢滴加到LA-CMBC水溶液中，继续避光搅拌24 h后对蒸馏水透析24 h。将溶液用探头超声处理，过0.45 μm滤膜即得。

2.6.2 阿霉素含量测定方法的建立 采用紫外分光光度法测定胶束制剂中阿霉素的含量。

（1）阿霉素对照品储备液的制备：以DMSO为溶剂配制200 μg/mL的阿霉素对照品储备液，避光备用。

（2）检测波长的确定：分别取适量阿霉素储备液、CMBC、LA-CMBC胶束溶液用DMSO稀释至适当质量浓度，在280～600 nm扫描其紫外吸收光谱。如图9可见，阿霉素在481 nm处有一比较大的特征吸收峰，偶联物CMBC和LA-CMBC在481 nm处均无吸收，说明选用LA-CMBC作为载体不会影响阿霉素的紫外吸收，因此，选用481 nm作为阿霉素定量测定的检测波长。

图9 阿霉素、CMBC、LA-CMBC溶液的紫外扫描图谱Fig.9 Ultraviolet scanning atlas of doxorubicin, CMBC and LA-CMBC solutions

（3）标准曲线的建立：取阿霉素对照品储备液用DMSO分别稀释配制成质量浓度为5、10、15、20、30、40 μg/mL的系列对照品溶液。于481 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，进行线性回归，得到阿霉素标准曲线的回归方程为Y＝0.019 2X＋0.004 5，R2＝0.999 4。可见阿霉素在5～40 μg/mL线性关系良好。

（4）精密度试验：取阿霉素储备液用DMSO稀释成5、20、40 μg/mL的阿霉素供试液，用紫外在同天内每个质量浓度测量5次得到日内精密度；连续测定5 d，得日间精密度。计算出低、中、高3种质量浓度的阿霉素供试液的日内RSD分别为1.83%、0.95%、0.68%；日间RSD分别为1.98%、1.52%、1.27%，均小于2.0%，满足分析测试的要求。

（5）回收率试验：分别配制250、1000、2000 μg/mL的阿霉素溶液各5份，各取0.2 mL，加入处方比例的LA-CMBC胶束溶液混匀后用DMSO定容至10 mL，即得质量浓度分别为5、20、40 μg/mL的阿霉素供试液，紫外测定各吸光度值，计算阿霉素的回收率，分别为98.83%、101.19%、100.79%，说明阿霉素与LA-CMBC胶束溶液不发生吸附作用，可认为该载体对药物含量测定没有影响，该方法可行。

（6）稳定性试验：按“2.6.1”项下方法制备阿霉素浓度为5、20、40 μg/mL的载药胶束供试液，分别在室温下于0、2、4、6、8、10、12、24 h测定紫外吸收。结果显示，3种质量浓度的供试液在24 h内的RSD分别为1.24%、1.68%、1.52%，表明在24 h内供试液稳定性良好。

（7）重复性试验：按“2.6.1”项下方法制备6份样品溶液，分别进行紫外测定，计算RSD值，考察重复性，结果RSD为1.49%，表明该方法重复性良好。

2.6.3 载药胶束中阿霉素的含量测定及结果 量取载药胶束0.5 mL于10 mL量瓶中，加入DMSO超声混匀并定容至刻度，按“2.6.2”项下的方法测定吸光度值，测得载药胶束中阿霉素的包封率为（69.67±3.87）%，载药量为（16.08±0.25）%（n＝3）（由于阿霉素是以疏水性小分子包载于自组装胶束中，其本身溶解度很低，故不考虑极少量游离阿霉素的量）。

包封率＝m1/m2

载药量＝m1/m总

m1为阿霉素在自组装胶束中的量，m2为阿霉素的投料量，m总为载药胶束的总质量

2.6.4 DOX/LA-CMBC载药胶束的理化性质考察及结果 取适量载药胶束溶液用蒸馏水稀释后，利用马尔文粒度仪检测，结果见图10。测得DOX/LACMBC载药胶束的平均粒径为（180.2±6.7）nm，PDI为0.140±0.003，Zeta电位为（-16.14±0.25）mV（n＝3）。

图10 DOX/LA-CMBC的粒径分布 (A) 和Zeta电位 (B)Fig.10 Particle size distribution (A) and Zeta potential (B)of DOX/LA-CMBC

2.6.5 不同pH值环境下载药胶束中阿霉素、黄芩苷的体外释放及结果 采用透析法，选取不同pH值（5.8、6.5、7.4）的PBS溶液作为释放介质，采用荧光分光光度法测定阿霉素在3种不同pH值PBS溶液中的标准曲线，结果分别为阿霉素荧光强度（F，pH 5.8）＝163.62X＋2.475 9，R2＝0.999 5；F（pH 6.5）＝158.09X＋0.166 9，R2＝0.999 1；F（pH 7.4）＝143.06X＋1.257 1，R2＝0.999 4；结果表明阿霉素在0.02～0.80 μg/mL荧光强度与质量浓度线性均良好。采用紫外法测定黄芩苷在3种PBS溶液中的标准曲线，结果分别为Y（pH 5.8）＝0.068 4X－0.006 1，R2＝0.999 1；Y（pH 6.5）＝0.066 8X－0.001 4，R2＝0.999 0；Y（pH 7.4）＝0.064 0X＋0.003 1，R2＝0.999 1；结果表明黄芩苷在0.1～20.0 μg/mL线性关系良好。

量取DOX/LA-CMBC溶液1 mL，置于透析袋内，密封好后浸入含20 mL释放介质的锥形瓶中，在37 ℃、100 r/min转速的条件下进行体外释放实验。在预设时间点取样1 mL，并同时补充等体积新鲜的释放介质。计算累积释放量，分别作阿霉素、黄芩苷的体外释放曲线（图11）。从释药曲线看出，胶束中阿霉素的释放均较为缓慢、持久，无明显突释现象。还表现出pH值敏感性，即在较低pH值条件下释放较快且多，在较高pH值条件下，释放较缓慢且较少。胶束中的黄芩苷在pH 7.4条件下只释放了26.16%，在pH 6.5条件下释放了38.24%，虽然比pH 7.4下释放较快，但是释放量依然较少，说明胶束在到达肿瘤部位前可以较好的保持结构的稳定性。而在pH 5.8条件下不仅释放快，释放量还达到了68.45%，说明胶束到达肿瘤部位时，胶束体系瓦解，酰胺键快速水解从而释放出黄芩苷。总之，阿霉素、黄芩苷的释放行为一致，均表现为pH值敏感性。

图11 载药胶束中阿霉素和黄芩苷在不同pH值释放介质中的释药曲线 ( , n = 5)Fig.11 Drug release curves of doxorubicin and baicalin in drug-loading micelles in different pH release media ( ,n = 5)

2.7 体外抗肿瘤活性检测及结果

采用MTT法检测胶束制剂的细胞毒性。实验中考察的黄芩苷的质量浓度分别为0.25、0.50、1.00、5.00、10.00 μg/mL。简而言之，将HepG2细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中培养过夜，试验组分别加入不同质量浓度的黄芩苷、阿霉素、CMBC、LA-CMBC和DOX/LA-CMBC溶液，对照组加入等体积培养液，每组5个复孔后培养48 h，之后弃培养液，每孔加10 μL MTT（5 mg/mL）和190 μL培养液后培养4 h，终止培养并弃上清，每孔加入150 μL DMSO，避光震荡10 min后于570 nm处测吸光度，计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率＝(A对照—A试验)/A对照

由表3看出，纯阿霉素对HepG2细胞生长抑制作用最强，黄芩苷、CMBC及LA-CMBC对细胞均有一定的抑制作用，并与浓度成依赖性。在实验浓度下，黄芩苷的抑制率从5%升至35%，CMBC抑制率从10%升至46%，LA-CMBC抑制率从14%升至51%，表明与黄芩苷相比，CMBC与LA-CMBC的抑制率均高于黄芩苷（P＜0.05），表明黄芩苷作为疏水端包裹于胶束中能显著提高其抗肿瘤效果。且LA-CMBC与CMBC相比，差异具有显著性（P＜0.05），可认为LA-CMBC比CMBC有较强抑制作用，一定程度上表明了乳糖酸的靶向作用。在胶束质量浓度为1～10 μg/mL内，DOX/LA-CMBC的抑制作用最强（P＜0.01），说明以LA-CMBC为载体共同递送阿霉素和黄芩苷可行。

表3 黄芩苷、阿霉素、CMBC、LA-CMBC和DOX/LA-CMBC对HepG2细胞的生长抑制率 ( , n = 3)Table 3 Growth inhibition rate of baicalin, doxorubicin, CMBC, LA-CMBC and DOX/LA-CMBC on HepG2 cells ( ,n = 3)

表3 黄芩苷、阿霉素、CMBC、LA-CMBC和DOX/LA-CMBC对HepG2细胞的生长抑制率 ( , n = 3)Table 3 Growth inhibition rate of baicalin, doxorubicin, CMBC, LA-CMBC and DOX/LA-CMBC on HepG2 cells ( ,n = 3)

与黄芩苷组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与CMBC组比较：#P＜0.05*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs baicalin group; #P ＜ 0.05 vs CMBC group

样品 细胞生长抑制率/%0.25 μg·mL-1 0.50 μg·mL-1 1.00 μg·mL-1 5.00 μg·mL-1 10.00 μg·mL-1黄芩苷 5.1±1.2 9.0±0.5 15.2±1.4 28.2±0.7 35.4±1.0阿霉素 35.0±2.4 53.4±1.5 62.3±2.0 73.1±1.6 79.2±1.2 CMBC 10.4±2.2 12.1±1.7* 20.6±2.5* 33.3±1.3* 46.0±1.7*LA-CMBC 14.2±1.6 15.1±1.9*# 25.6±2.4*# 40.5±1.0*# 51.3±1.5*#DOX/LA-CMBC 28.3±2.1*# 31.1±1.6*# 47.6±1.2**# 63.5±1.8**# 70.2±0.9**#

3 讨论

本研究在OCMC偶联黄芩苷形成的前药基础上进行靶向修饰，获得LA-CMBC并以其为载体制备载药胶束，实现黄芩苷与阿霉素的共同递送，所制备的胶束具有较好的制剂学性质。图12为DOX/LA-CMBC胶束形成示意图。OCMC骨架构成亲水性外壳，增加了胶束的血液循环时间，在胶束表面形成水化层而阻止血浆调理素等蛋白吸附在胶束表面，避免被网状内皮系统吞噬[2]。疏水性药物黄芩苷缔合为疏水内核同时作为一种药物，与阿霉素共同递送来发挥协同抗癌作用。

图12 DOX/LA-CMBC载药胶束形成示意图Fig.12 Schematic diagram of DOX/LA-CMBC drug-carrying micelle formation

在考察胶束体外释放时发现当释放介质pH值为5.8时，胶束体系出现浑浊现象，但全程未见有明显的沉淀，推测在酸性条件下胶束体系稳定性下降，从而使体系趋于瓦解，但并未达到彻底裂解、聚集并沉淀的程度，这与文献报道一致[13]。

细胞毒性实验表明，纯阿霉素对HepG2细胞生长抑制作用最强，这是因为纯阿霉素溶液通过自由扩散进入细胞，而胶束通过靶向作用及实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR效应）到达肿瘤环境并存在缓慢的胞内释药行为，所以使进入并富集于细胞的药量少于纯阿霉素，但是阿霉素选择性差，毒副作用大。CMBC和LA-CMBC的抑制作用比DOX/ LACMBC的弱，这是由于后者除了有乳糖酸介导的靶向作用还会通过体系瓦解、酰胺键水解释放DOX、黄芩苷2种药物，且据文献数据[1,24]推测2药物可能具有协同的抗肝癌作用。具体机制如下：褚冬青等[25]发现将黄芩苷与DOX联用可以诱导舌癌细胞凋亡，并且协同增效机制可以下调Bcl-2、磷酸化粘着斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase，p-FAK）及磷酸化酪氨酸蛋白激酶（phosphorylated tyrosine protein kinase，p-Src）蛋白表达；郁洁雯等[26]将黄芩苷与阿霉素联用抑制脑神经胶质瘤细胞，其效果优于单个药物治疗，可见二者联合应用具有协同抗肿瘤作用。肿瘤的发生从来都不是一种基因异常造成的，联合给药才可增强药效。黄芩苷可以阻滞HepG2肝癌细胞在S期，通过促进人肝癌细胞的E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cd）表达，抑制整合素-β1（integrin-β1）表达、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）mRNA和蛋白的表达以及抑制STAT3蛋白的磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的增殖[27]。阿霉素可通过下调Bcl-2的蛋白表达以及诱导Wnt通路抑制剂的表达来诱导肝癌细胞凋亡[28]。可见黄芩苷和阿霉素可以通过不同的作用机制诱导肝癌细胞凋亡。故本研究推测，当胶束通过主动靶向作用及EPR效应到达肿瘤环境释放黄芩苷、阿霉素时，两者可以发生协同作用。本研究将在动物水平上继续考察两者的协同效应，为中草药与化疗药物的协同抗肝癌研究奠定基础。

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