肿瘤相关成纤维细胞来源外泌体ciRS-7经miR-7/IGF1R轴促进胰腺癌细胞糖酵解

谷甸娜，陈涵斌，钱方璟，陈扬，叶志强

1.温州医科大学附属第一医院 肿瘤内科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；3.温州医科大学附属第一医院 乳腺外科，浙江 温州 325015

胰腺癌是目前已知恶性程度最高的肿瘤之一，其早期诊断困难，易于侵袭转移，5年生存率只有5%左右[1]。胰腺癌组织内富含大量的结缔组织，血供不足造成缺氧、低营养的微环境，快速增殖的肿瘤更是增加了对物质代谢的需求[2]。胰腺癌具有高水平的糖酵解代谢，这不仅可满足肿瘤快速增殖时对ATP、生物大分子的需求，而且乳酸可酸化肿瘤微环境促进转移[3-4]。因此，探索通过阻断胰腺癌糖酵解来控制肿瘤能量生成正备受关注。

环状RNA ciRS-7又叫做小脑变性相关蛋白1 反义转录物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein transcript, CDR1as），包含70多个miR-7的识别位点，可以抑制miR-7活性而提高miR-7靶基因表达[5]。本课题组之前的研究表明，miR-7可通过调控糖酵解代谢而抑制胰腺癌进展[6]。胰腺癌微环境中最显著的特征是含有密集的肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts, CAFs），CAFs对于胰腺癌细胞不是简单的旁观者，而是肿瘤发展的关键推手[7]。前期预实验提示，由胰腺癌组织分离的CAFs可分泌大量外泌体，其内具有高水平ciRS-7。本研究旨在探讨CAFs经外泌体ciRS-7对胰腺癌细胞糖酵解代谢的影响及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养及外泌体制备 人胰腺癌细胞PANC-1购自中国科学院（上海）；胰腺癌CAFs取自手术采集的新鲜胰腺癌组织，用差速贴壁法分离、纯化后获得胰腺癌CAFs，并进行细胞鉴定。PANC-1、CAFs细胞培养于含10%去外泌体胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合至75%～80%时，用胰酶消化、传代培养。取对数期CAFs细胞接种到6孔板，每孔5×105个细胞，24 h后细胞使用LipofectamineTM3000转染试剂，将敲降质粒siRNA-ciRS-7、过表达质粒EgciRS-7及对照质粒转染至CAFs细胞（质粒构建参考文献[8]），构建敲降、过表达ciRS-7及对照质粒胰腺癌CAFs，转染后培养48 h离心收集细胞上清液。将胰腺癌相关成纤维细胞培养液吸入离心管并按如下梯度离心：4 ℃条件下，1 000×g离心10 min，3 000×g离心30 min，10 000×g离心60 min，100 000×g离心 70 min，将沉淀重悬于PBS缓冲液中。

1.2 纳米粒子追踪分析技术（nanoparticle tracking analysis, NTA）检测外泌体粒径及浓度 将提纯的外泌体标本用PBS稀释50～100倍，PBS冲洗机器完成后，设置机器，多点读数，用1 mL注射器将稀释好的外泌体打入机器中，进行测试。粒径分析仪器：Nanosight NS300。

1.3 实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）法检测CAFs外泌体中ciRS-7及胰腺癌细胞中糖酵解关键酶基因mRNA的表达 使用TRIzol试剂分别提取外泌体及胰腺癌细胞中总RNA，反转录合成cDNA，按照RT-PCR试剂盒说明书，在荧光定量PCR仪上检测糖酵解通路上关键酶mRNA表达水平，两步法扩增程序：第一步： 预变性95 ℃ 30 s循环1次；第二步：PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循环40次。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR实验中所用引物序列

1.4 Western blot检测蛋白 利用蛋白提取试剂盒提取PANC-1细胞总蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶中封闭2 h，分别加入乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）抗体（美国Abcam公司，ab47010，1:2 000）、己糖激酶-II（hexokinase-II, HK-II）抗体（美国Abcam公司，ab227198，1:3 000）、胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R）抗体（美国Abcam公司，ab131476，1:500）、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB，又称AKT）抗体（美国Abcam公司，ab8805，1: 1 000）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B, p-PKB，又称p-AKT）抗体（美国Abcam公司，ab38449，1:1 000）在4 ℃孵育过夜，在室温下，将膜与HRP标记的二抗孵育2 h，洗膜后显影扫描记录数据。

1.5 双荧光素酶报告基因实验 在胰腺癌细胞中，采用双荧光素酶法确定ciRS-7与miR-7之间的关系。根据生物信息学软件TargetScan的分析，构建双荧光素酶报告基因载体，包括pmirGLO-ciRS-7-WT及pmirGLO-ciRS-7-MT。野生型荧光报告质粒序列片段ciRS-7-WT，突变ciRS-7与miR-7结合位点构建ciRS-7-MT被克隆到pmirGLO载体（美国Promega公司）。将miR-7 mimics或miR-7 inhibitor与pmirGLO载体共转染到PANC-1细胞中，转染48 h后，以海肾荧光素酶活性作为内参，检测萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的相对值，统计检测结果。

1.6 胰腺癌细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、乳酸产量的检测 分别按照LDH活性比色分析试剂盒、乳酸比色分析试剂盒II（美国BioVision公司）说明书检测活性及乳酸生成。

1.7 细胞增殖实验 应用CCK8试剂检测细胞增殖。把胰腺癌细胞接种于96孔板，每孔接种3 000个细胞。至接种次日开始检测，检测时每孔加入10 μL CCK8试剂，待测样品三复孔，37 ℃孵育2 h，用酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.8 统计学处理方法 应用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，两组间均数比较采用Student’st检验；多组间均数比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ciRS-7在胰腺癌CAFs外泌体中的表达 CAFs培养上清液中的外泌体，采用NTA技术对分离获得的颗粒的布朗运动进行追踪和分析（见图1A、图1B）。进一步检测胰腺癌CAFs培养上清液中的外泌体ciRS-7的表达水平，RT-qPCR检测结果显示，与人胰腺星状细胞（human pancreatic stellate cells, HPSC）相比，ciRS-7在CAFs外泌体中的表达水平显著上调（P＜0.01），见图1C。

图1 ciRS-7在胰腺癌CAFs外泌体中的表达

2.2 胰腺癌CAFs释放的外泌体促进胰腺癌细胞糖酵解和增殖 为了探究胰腺癌CAFs来源外泌体对胰腺癌糖酵解的影响，将分离出的外泌体用于处理胰腺癌细胞，发现外泌体明显促进胰腺癌细胞的增殖（P＜0.01），并且提高了胰腺癌细胞的糖酵解水平 （P＜0.01），相反地，用去外泌体条件培养基上清液处理可抑制胰腺癌细胞的增殖（P＜0.01）和糖酵解水平（P＜0.01）。见图2。

图2 胰腺癌CAFs释放外泌体促进胰腺癌细胞糖酵解和增殖

2.3 敲降胰腺癌CAFs的ciRS-7表达后其外泌体可抑制胰腺癌细胞糖酵解相关基因的表达 构建过表达与敲降ciRS-7的胰腺癌CAFs，并验证其外泌体中ciRS-7的表达水平（P＜0.01）。将CAFs的外泌体加入PANC-1细胞，运用RT-qPCR法检测胰腺癌细胞糖酵解通路关键酶mRNA表达，Western blot检测LDHA与HK-II蛋白的表达。结果发现过表达ciRS-7提高了PANC-1细胞糖酵解关键酶mRNA水平（P＜0.01）和蛋白LDHA、HK2的表达（P＜0.01），而敲降ciRS-7组则下调了相应基因的表达（P＜0.01）。见图3。

图3 敲降胰腺癌CAFs的ciRS-7表达后外泌体可抑制胰腺癌细胞糖酵解相关基因的表达

2.4 ciRS-7在胰腺癌细胞中经miR-7/IGF1R/AKT通路促进癌细胞糖酵解 双荧光素酶报告基因检测提示，miR-7 mimics可降低ciRS-7-WT组的荧光素酶活性（P＜0.01），但不影响胰腺癌细胞ciRS-7-MT组的荧光素酶活性（P＞0.05）。为了阐明外泌体ciRS-7促进胰腺癌细胞糖酵解的机制，将过表达、敲降ciRS-7的CAFs培养基离心获得外泌体加入胰腺癌细胞中（每1×106胰腺癌细胞中加入约1×108外泌体），检测糖代谢相关通路上IGF1R基因的表达，以及下游AKT蛋白水平。结果观察到miR-7的靶基因IGF1R mRNA表达及AKT蛋白被过表达ciRS-7组增强，加入miR-7 mimics可以逆转IGF1R mRNA表达，而ciRS-7的敲低降低了IGF1R/AKT通路信号（P＜0.01），推测ciRS-7在胰腺癌细胞中可能经miR-7/IGF1R/AKT通路促进癌细胞糖酵解。见图4。

图4 ciRS-7在胰腺癌细胞中经miR-7/IGF1R/AKT通路促进癌细胞糖酵解

3 讨论

CAFs是胰腺肿瘤微环境的重要基质细胞[9]，可通过分泌外泌体和肿瘤细胞间进行信息传递，在肿瘤的生长、转移、血管新生、免疫逃逸、肿瘤耐药中发挥重要的调控作用[10-11]。在胰腺癌中，CAFs外泌体可调控胰腺癌的增殖和吉西他滨的耐药[10]，然而有关外泌体对胰腺癌的糖酵解的影响尚未见报道，所以本研究定位于胰腺癌中CAFs分泌的外泌体对胰腺癌的糖酵解的研究，旨在发现肿瘤微环境调控胰腺癌糖酵解的新机制。

circRNA具有高度保守的特征和组织发育特异性表达模式，可在外泌体中富集，能从体液中检测到[12-13]。近年来研究发现外泌体circRNA在胰腺癌进展和转移中起重要作用。据报道，外泌体 circPED8A与胰腺癌淋巴管浸润、TNM分期和低生存率有关，并通过miRNA-338/MET/MAPK1或PKB促进侵袭转移[14]。而胰腺癌细胞分泌的外泌体circIARS可下调miRNA-122/ZO-1轴，上调RhoA和RhoA-GTP的水平，使内皮细胞通透性增加，促进转移、血管侵犯[15]。 然而有关胰腺癌CAFs分泌的外泌体中circRNA对胰腺癌的发展影响却鲜有报道。

本研究发现在胰腺癌CAFs分泌的外泌体中ciRS-7呈高表达状态，具有促进胰腺癌细胞糖酵解和增殖的作用。而敲降胰腺癌CAFs中ciRS-7的表达，可以通过其外泌体抑制胰腺癌细胞糖酵解，且证实这种作用与ciRS-7/miR-7/IGF1R信号轴相关。糖酵解是胰腺癌的重要特征，具有促进肿瘤发生发展的作用。本研究中，通过检测LDH活性、乳酸的产生及糖酵解关键酶LDHA及HKII，发现去CAFs外泌体或下调胰腺癌CAFs中ciRS-7的表达，在体外具有抑制胰腺癌细胞糖酵解的作用。

环状RNA调控肿瘤发展是通过环状RNA/miRNA/mRNA之间的对话实现的[16]。既往研究证实miR-7在胰腺癌细胞中呈低表达状态[6]，而miR-7正是ciRS-7的候选靶标，本研究发现在胰腺癌细胞中ciRS-7可通过海绵吸附miR-7，上调miR-7的靶基因IGF1R的表达，从而活化IGF1R/AKT信号来增强糖酵解作用。IGF1R是一种跨膜的酪氨酸蛋白受体，是细胞体内生长所必需的，对细胞的增殖、分化、凋亡起着重要的作用[17]。IGF1R/AKT信号参与有氧糖酵解过程，AKT可通过诱导葡萄糖转运蛋白的表达及膜易位，提高HK表达与活性，激活磷酸果糖激酶PFK从而促进糖酵解代谢[18]。本研究中，IGF1R/AKT信号的上调促进胰腺癌细胞糖酵解，这与其在肝癌[19]、乳腺肿瘤[20]及胶质瘤[21]中的作用相一致。

综上所述，本研究发现由胰腺癌CAFs分泌的外泌体中ciRS-7呈高表达状态，敲降CAFs ciRS-7的表达，可以通过外泌体抑制胰腺癌细胞的糖酵解及增殖，而且这种作用与miR-7/IGR1R/AKT通路相关。