GLP1R基因多态性与中国汉族人群2型糖尿病风险及血糖、血脂、胰岛功能的关系

郑文文，郑超，周心禾

1.嘉兴市第二医院 内分泌科，浙江 嘉兴 314001；2.浙江大学医学院附属第二医院 内分泌科，浙江 杭州 310009；3.温州医科大学附属第二医院 内分泌科，浙江 温州 325027

胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）主要由小肠远端和近端结肠的肠道L细胞分泌，由胰高血糖素原基因编码，是一种由30个氨基酸组成的多肽[1-2]。GLP-1的特异性靶点为胰高血糖素样肽1受体（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP1R），GLP-1通过与GLP1R结合，以葡萄糖依赖方式促进胰岛素分泌，从而维持机体血糖稳态[3]。因此，GLP1R功能受损将会导致胰岛β细胞的功能障碍。

编码GLP1R的人类GLP1R基因定位于6号染色体的短臂（chr 6p21），包含13个外显子[4]。其基因多态性的发生可能导致GLP1R的结构改变，从而使得GLP1R出现功能障碍[5]。在HapMap II期数据库（http://www.hapmap.org）中，共鉴定出33个单倍型标记的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位点。本研究选择其中3个位点，即rs3765467、rs2268657和rs6923761，目前有关该3个位点的研究数据在我国十分有限。本研究通过探讨GLP1R基因rs3765467、rs2268657和rs6923761多态性与中国汉族人群2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）及血糖、血脂、胰岛功能的相关性，为T2DM的病因诊断、治疗及预后提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2016年3月至2018年6月温州医科大学附属第二医院的T2DM患者526例，其中男286例，女240例，均符合WHO（1999年）诊断标准，排除1型糖尿病、特殊类型糖尿病、严重肝肾功能损害者、肿瘤等疾病。选取健康志愿者334例作为对照组，其中男183例，女151例。本研究已通过医院医学伦理委员会的批准，所有研究对象均知情同意。

1.2 临床及生化检测 记录研究对象的年龄、性别，并测量身高、体质量，体质量指数（body mass index, BMI）。留取所有研究对象清晨空腹静脉血，由温州医科大学附属第二医院检验科专人测定空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、甘油三酯（triglyceride, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）。另外留取T2DM患者空腹及餐后2 h静脉血，检测空腹C肽（fasting plasma C-peptide, FP-C）、餐后2小时血糖（2-hour postprandial blood glucose, 2hPG）、餐后2小时C肽（2 hours postprandial C-peptide, 2hP-C），并根据FBG及FP-C水平通过HOMA2 calculator（www.dtu.ox.ac.uk/homacalculator/index.php）软件计算获得胰岛β细胞功能指数（HOMA-β），胰岛素敏感指数（HOMA-IS）以及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。

1.3 基因组DNA提取及检测 留取所有研究对象的2 mL外周静脉血，置于乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）抗凝管中，按照DNeasy血液/组织基因组DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）说明书提取样本DNA。应用竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele specific PCR, KASP）技术检测GLP1R基因rs3765467、rs2268657和rs6923761三个位点的基因型。步骤如下：先把所有DNA样本进行质检，将质检合格的DNA稀释至浓度为5 ng/μL。取2 μL DNA样本，55 ℃ 45 min烘干，并配置混合物（mix），3 μL体系[包括引物mix及2X KASP master mix（北京梓熙生物科技有限公司）]，在ABI 7900仪器上进行预读，然后在ABI 7900 PCR仪中进行PCR反应，94 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，61 ℃ 1 min，10个循环；94℃ 20 s，55 ℃ 1 min，26个循环；72 ℃ 1 min。最后进行基因分型和判读。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行统计分析。基因型频率分布作Hardy-Weinberg平衡检验；计数资料采用例数和百分率表示，采用χ2检验或Fisher精确检验进行组间比较；计量资料中符合正态分布，采用±s表示，不符合正态分布，采用M（P25，P75）表示，分别采用独立样本t检验或秩和检验进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T2DM组与对照组一般资料与生化指标比较 T2DM组与对照组在性别、LDL-C、HDL-C方面差异无统计学意义（均P＞0.05）；T2DM组的年龄、BMI、TG、TC、FBG、HbA1c水平显著高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 T2DM组与对照组的临床指标比较

2.2 各SNP位点Hardy-Weinberg平衡检验 GLP1R基因rs3765467（C＞T）、rs2268657（G＞A）、rs6923761（G＞A）三个位点分布情况见表2。对对照组中该三个位点的基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验，三个基因位点分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.782、0.570、0.759），提示研究样本具有群体代表性。

2.3 各SNP位点基因型和等位基因频率分布 T2DM组GLP1R基因：rs3765467位点CC基因型和C等位基因的频率均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05），见表2。在隐性模型中，T2DM组GLP1R基因rs3765467位点CC基因型频率显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表2 GLP1R基因各位点基因型和等位基因频率分布[例（%）]

表3 两种遗传模型中GLP1R基因各位点基因型频率分布[例（%）]

2.4 T2DM影响因素的Logistic回归分析结果 以是否发生T2DM作为因变量，以rs3765467隐性模型、年龄、性别、BMI、TG、TC为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，Logistic回归模型在调整了年龄、性别、BMI、TG、TC后，rs3765467位点CC基因型是T2DM发病的独立危险因素，携带CC基因型患者发生T2DM的风险是CT或TT基因型携带者的1.724倍（OR=1.724，95%CI=1.217～2.443，P= 0.002），见表4。

表4 T2DM影响因素的多因素Logistic回归分析

2.5 GLP1R基因多态性与BMI、血脂、血糖代谢关系 在隐性模型中，GLP1R基因（rs3765467、rs2268657、rs6923761）的基因型与BMI、血糖、血脂之间的关系见表5。在GLP1R基因rs3765467位点中，CC基因型HbA1c水平高于CT+TT基因型（t= -2.517，P=0.012）；而在GLP1R基因rs2268657位点中，GG基因型HDL-C水平显著高于GA+AA基因型（t= -2.162，P=0.031）。

2.6 T2DM组中GLP1R基因rs3765467位点胰岛功能情况 在T2DM组中，GLP1R基因rs3765467位点CC基因型的FP-C、HOMA-β、HOMA-IR水平均低于CT+TT基因型，差异均有统计学意义（t=1.978，P=0.048；t=2.308，P=0.021；t=2.012，P=0.045），见表6。

表6 T2DM组中GLP1R基因rs3765467位点胰岛功能比较

3 讨论

已有相关研究发现GLP1R基因多态性与T2DM、肥胖、胰岛素分泌、GLP1R受体激动剂药物疗效等具有相关性[6-8]。在我国鲜有研究发现GLP1R基因rs3765467、rs2268657、rs6923761三个位点与T2DM的发病风险相关，而有关其对代谢指标以及胰岛功能影响的研究更是少见。本研究采用病例-对照研究对中国汉族人群T2DM的GLP1R基因三个位点基因多态性的分布特点及对相关指标的影响进行分析，发现GLP1R基因rs3765467位点基因多态性与T2DM的发病风险明显相关，经过Logistic回归分析校正混杂因素后，发现携带CC基因型者患T2DM的风险是携带CT+TT基因型者的1.724倍，表明CC基因型是T2DM的危险因素。但本研究未发现rs2268657、rs6923761与T2DM的发病风险相关，这可能是由于样本量较少且不同种族中这些位点的表达存在差异，需进一步扩大样本量予以验证。

进一步研究GLP1R基因三个位点与血糖、血脂等代谢指标的关系时发现，rs3765467位点CC基因型HbA1c水平明显高于CT+TT基因型；rs2268657位点GG基因型HDL-C水平显著高于GA+AA基因型。这在既往研究中亦有类似报道，DE LUIS等[9]关于肥胖人群的研究发现，与rs6923761位点GG基因型人群相比，GA/AA基因型人群具有更优的BMI、TG和HDL-C水平。李蕊等[10]的研究则发现，在T2DM人群中，携带rs10305420位点CC基因型者的HDL-C水平明显高于CT/TT基因型者；携带rs3765467位点GG基因型者的TG水平显著低于GA/AA基因型者。但本研究发现的GLP1R基因位点与血糖、血脂的关系与以往的研究不同，补充了既往研究。上述研究表明GLP1R基因变异可能会影响机体的血糖、血脂代谢。

GLP-1通过与胰岛、肠道、脑、肺、肾脏、下丘脑、心脏等器官上的GLP1R结合发挥相应的作用。GLP1R是G蛋白偶联受体B1家族成员，主要在胰岛β细胞内表达，含有463个氨基酸[11]。在胰岛上，GLP-1与胰岛β细胞上的GLP1R结合，激活环磷酸腺苷酶依赖的蛋白激酶A信号通路，从而促进胰岛素释放，抑制胰高血糖素分泌，抑制胰岛β细胞凋亡，促进胰岛β细胞增殖[12]。因此，GLP1R基因变异可能改变GLP1R对体内GLP-1的反应。GLP1R基因rs3765467位点是目前发现的与GLP1R功能改变相关的SNPs之一，该突变是由谷氨酰胺取代了第131位精氨酸[8]。已有研究发现rs3765467位点与胰岛β细胞功能相关。LI等[13]通过研究Roux-en-Y胃旁路术后的肥胖T2DM患者发现rs3765467位点可能通过削弱GLP-1与GLP1R的相互作用导致胰岛β细胞功能障碍和凋亡。NISHIYA等[14]研究也发现在高能量摄入的日本男性研究者中携带rs3765467位点GG基因型者HOMA-β水平明显低于AA+AG基因型者，提示GG基因型可能是降低胰岛素分泌的重大风险。本研究在对携带rs3765467位点的T2DM患者分析中发现，携带CC基因型者空腹C肽、HOMA-β水平显著低于CT+TT基因型者，表明CC基因型可能是胰岛β细胞功能障碍，胰岛素分泌下降的重要风险因素。这与既往研究结果相符。而CT+TT基因型患者HOMA-IR水平明显高于CC基因型患者，提示携带CT+TT基因型者可能更容易出现胰岛素抵抗。这在既往研究中尚未发现，期待进一步扩大样本量来研究明确。

综上所述，本研究初步探讨了GLP1R基因多态性与T2DM之间的相关性，发现GLP1R基因rs3765467位点与中国汉族人群T2DM的风险相关，且相关位点与血糖、血脂及胰岛功能存在一定关联。