芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺证大鼠肺血管Bax、Bcl-2表达的影响

石孟瑶，朱洁，方莉，童佳兵，王小乐，高雅婷，刘桐，李泽庚，*

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一种进行性和损伤肺血管、肺实质以及气道的慢性疾病[1]。肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PH)作为COPD的常见合并病，是导致COPD预后不良的重要因素。肺血管重塑是PH的重要病理改变，表现为肺血管壁增厚导致的管腔狭窄，血流阻力增加[2-3]。早期对肺血管重构及时干预，控制COPD进一步发展合并PH，对降低病死率至关重要。而肺血管内皮细胞的增殖与凋亡失衡，肺内皮细胞凋亡，平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs )过度增殖迁移是促使肺血管重构的主要机制之一[4]。因此，干预肺血管内皮细胞的增殖与凋亡失衡是防治COPD合并肺动脉高压的有效方法。

COPD属中医学的“肺胀”“喘病”等范畴，该病主要病理特点为本虚标实，虚病位主累及肺、脾、肾三脏，标实主要指痰浊、血瘀[5-6]。清张璐《张氏医通 肺萎肺胀》曰：“痰夹瘀血碍气而胀”[7]，从现代医学角度出发，脉为血之府，肺血管重构相关病变类似于血脉不利导致血液瘀阻，肺为储痰之器，痰瘀互结聚于肺，辨为痰瘀阻肺之证[8]。前期的动物实验证明芪白平肺胶囊能够干预肺血管重构的[9]，细胞实验证明芪白平肺胶囊可以通过线粒体凋亡途径，降低低氧造模下的PASMCs中Bcl-2水平，提高Bax的水平，抑制了PASMCs增殖能力[10]，但其相关的体内机制有待进一步明确。为此，本研究在前期研究基础上观察芪白平肺胶囊对COPD痰瘀阻肺大鼠肺血管的凋亡/增殖程度的影响，探究其改善COPD合并PH的可能机制。

1 材料及方法

1.1 主要仪器

香烟烟熏箱(自制,长130 cm×宽80 cm×高75 cm)；台式冷冻离心机(安徽，嘉文仪器装备有限公司)；生物组织自动脱水机(湖北，亚光)；生物组织包埋机(湖北，亚光)；徕卡切片机 (德国，Leica)；显微镜(日本，OLYMPUS)；荧光定量PCR仪(美国，Thermo Scientific)。

1.2 主要试剂与药品

芪白平肺胶囊由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；雄狮牌香烟(焦油：11 mg，烟碱：1.2 mg，浙江中烟工业公司)；大鼠血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF);ELISA试剂盒(武汉 基因美，JYM0634Ra)；Trizol(America Life technogies，251804)，Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(上海，novoprotein，1910G08)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(大连，TaKaRa，AJ51485A)，兔抗大鼠Bax抗体(上海 abcam，ab32503)；兔抗大鼠Bcl-2抗体(上海 abcam，ab32124)，通用型二抗试剂盒(北京 Zsbio，PV-6000)。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，由山东省实验动物中心提供，许可证号：SCXK20190003。安徽中医药大学动物房饲养，自由取食、饮水，保持室内温度(22～24℃)及相对湿度(40%～50%)稳定，采光好，室内干净整洁。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分组给药

参照团队前期造模方法[11]建立COPD痰瘀阻肺证病证结合大鼠模型。30只SPF级大鼠随机分成正常组、模型组、芪白平肺胶囊组(10只/组)。每天将模型组与芪白平肺胶囊组大鼠置于自制的1 m3熏烟箱内烟熏，每天烟熏1 h，每次20支香烟。烟熏后将大鼠置于常压低氧装置内，每天低氧5 h(氧浓度10%～10.5%，CO20.03%左右)。连续造模4周，6 d/周。正常组大鼠正常饲养。其中，芪白平肺胶囊组每天造模结束后予以药物灌胃1次(10 mL/kg，每1 mL含芪白平肺胶囊0.1 g)，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。

1.4.2 肺组织病理检查

取右肺上叶于4%甲醛固定48 h后进行石蜡包埋、切片、制片，后进行HE染色观察肺组织病理形态。

1.4.3 ELISA检测血清中VEGF的表达水平

大鼠末次给药后，经麻醉，腹主动脉取血，经4℃ 800×g离心15 min，取上层血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中VEGF表达水平。

1.4.4 荧光定量PCR法检测肺血管中Bax、Bcl-2基因表达

取适量组织充分研磨，加入1 mL Trizol，孵育10 min，12 000 r/min 4℃ 离心10 min，取上清液，加入一半体积无水乙醇，混匀，静置2 min，12 000 r/min 4 ℃ 离心3 min，弃废液，加入500 μL洗涤液，静置2 min，12 000 r/min 4℃ 离心30 s，弃废液。按说明书准备相应反应混合物，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，取出上述反应液，即为cDNA，采用SYBR Green 荧光PCR检测组织中的Bax、Bcl-2 mRNA表达。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.4.5 Western blot检测肺血管组织的Bax、Bcl-2蛋白水平

分离肺叶外肺动脉，按50 mg加入500 μLRIPA裂解液(含1 mmol PMSF)，冰上匀浆并裂解20 min后，经12 000r/min 4 ℃,离心10 min后收集含有总蛋白的上清液，按1∶4比例加5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液和上清液，涡旋混匀后，100 ℃煮沸8 min制备样品。待样品冷却到室温后，Western blot法检测样品中Bax、Bcl-2蛋白表达情况，其中Bax和Bcl-2抗体按1∶1 000比例稀释，二抗按1∶10 000稀释。

1.4.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理形态对比

正常组大鼠肺泡结构未见明显破坏，肺血管管壁薄，内皮细胞连续均匀排列，管壁各层未见明显浸润的炎性细胞、无明显增生的平滑肌细胞。模型组可明显看见肺泡结构破坏，融合，管腔内有渗出物，肺血管增厚明显，管壁有炎症细胞浸润，管腔狭窄。芪白平肺胶囊组大鼠有少量肺泡壁结构破坏，管壁各层有少许炎症细胞浸润，肺血管增厚程度较模型组明显减低，见图1。

图1 肺组织HE染色(×200)

2.2 血清中VEGF表达水平比较

与正常组相比，模型组的血清VEGF表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，芪白平肺胶囊组VEGF水平明显降低(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血清VEGF水平比较

2.3 肺血管组织中的Bax、Bcl-2 mRNA表达

与正常组相比，模型组肺血管组织中Bax mRNA表达水平明显降低(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表达明显增多(P<0.01)；与模型组相比，芪白平肺胶囊组Bax mRNA表达增多(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表达降低(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠组织Bax、Bcl-2mRNA相对表达量比较

2.4 肺血管组织的Bax、Bcl-2蛋白表达比较

与正常组相比，模型组肺血管组织中Bax蛋白表达水平降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.01)；与模型组相比，芪白平肺胶囊组Bax蛋白表达相对增多(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01),见表4。各组大鼠肺血管中Bax、Bcl-2蛋白条带图见图2。

表4 各组大鼠肺血管组织Bax、Bcl-2蛋白相对表达量比较

注：A.正常组；B.模型组；C.芪白平肺胶囊组。图2 各组大鼠肺血管中Bax、Bcl-2蛋白条带图

3 讨论

COPD在中医属于“肺胀”“喘证”等范畴，以虚为本，痰、瘀为标，病位在肺，痰瘀阻肺证是COPD常见证型之一[12-13]，有研究基于数据挖掘法发现痰湿证、血瘀证是COPD稳定期常见基础证候[14]。用现代医学观点联系，可理解为肺血管与肺络有一定关联，肺络受损与肺血管重构有一定联系[15]。肺血管壁主要分为3层：内膜、中膜层、外膜层，当受到低氧等刺激，肺血管各层均发生变化，其中主要由效应细胞—PASMCs组成的中膜层异常肥大、增殖、迁移到内膜层导致肺血管管腔狭窄[16]，血液循环不畅，机体处于高凝状态，进而发生肺动脉高压，导致肺心病。这种肺血管的异常增生状态主要跟肺血管平滑肌细胞增殖及抵抗凋亡有关，也就是一种增殖与凋亡的失衡状态[17]。芪平白肺胶囊功效主益气活血化瘀，临床上对COPD有一定疗效，能够干预肺血管重构，延缓COPD进一步发展成PH[18]。

Bcl家族蛋白在细胞凋亡机制中发挥着决定性作用，其中Bcl家族蛋白成员Bax促进细胞凋亡，Bcl-2作为控制凋亡的关键蛋白可以结合Bax从而达到抗凋亡的效果[19-20]，研究发现香烟刺激下肺血管中Bax蛋白及mRNA表达降低，Bcl-2蛋白及mRNA表达升高且随着吸烟时间增多而表达增加[21]。刘杨等[22]研究发现异绿原酸A可以降低成纤维细胞的Bcl-2表达，促进Bax表达，促进关节请内成纤维细胞的凋亡，减弱成纤维细胞抗凋亡的能力，达到改善关节腔积液的效果。本实验结果证明芪白平肺胶囊治疗后的COPD痰瘀阻肺证大鼠，Bax基因及蛋白升高表达水平增高，Bcl-2基因及蛋白的表达降低，说明芪白平肺胶囊能够导致肺血管平滑肌细胞趋向凋亡，起到抑制肺血管中细胞的增殖效果，改善血管管腔狭窄。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种血管损伤因子，主要表达于血管平滑肌及气道中，在吸烟、低氧、炎症等刺激因素影响下，VEGF的分泌增多能够，导致血管通透性增加及血管内皮增殖，参与肺血管重构[23]。研究发现溴域抑制剂可以通过抑制VEGF/PI3K/AKT通路，促进Bax表达水平升高，降低Bcl-2表达水平，促进胶质瘤干细胞凋亡[24]。谢文英等[25]研究发现二陈汤能够降低COPD大鼠肺组织中VEGF水平从而抑制肺血管重构。本研究结果显示模型组的大鼠血清中VEGF的水平升高，而芪白平肺胶囊组的大鼠血清中VEGF水平降低，说明芪白平肺胶囊可以降低VEGF水平抑制肺血管平滑肌细胞增殖及迁移，干预肺血管重构。

本研究发现，芪白平肺胶囊改善COPD痰瘀阻肺证大鼠肺血管重构的机制可能与降低了血清中VEGF的水平及调控Bax/Bcl-2蛋白的表达，改善血管凋亡与增值的失衡有关。然而芪白平肺胶囊是否通过下调VEGF水平抑制PI3K/AKT通路，增加肺血管中的Bax的含量，降低Bcl-2的含量还需进一步研究。