二妙散水提液的急性毒性试验研究

刘敏，宣自华，丁捷敏，孟祥文，贾晓益*

(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012；2.安徽省中药复方重点实验室，安徽 合肥 230012;3.安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230012)

二妙散源于元代医家朱丹溪的《丹溪心法》，由苍术和黄柏1∶1配伍而成,主治湿热下注、下焦湿疮、足膝红肿热痛。在中医基础理论中二妙散是清热燥湿的基础名方[1]。其中黄柏为君药，是芸香科黄檗属植物黄柏或黄皮树的干燥树皮，其味苦、性寒，归肾、膀胱经[2]。药典记载主要功效为清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮；苍术为菊科植物北苍术或茅苍术的干燥根茎，其味甘而辛烈，性温而燥，化湿运脾，用于湿阻中焦，风湿痹痛，眼目昏涩。现代药理研究发现，黄柏中主要含有生物碱类，甾醇类，内脂等化学成分[3]，苍术根茎主要含有挥发油，油中主要含有β-桉油、苍术醇、苍术素等成分[4]。黄柏和苍术具有抗菌、抗炎、止痛、改善机体免疫功能等作用[5-10]。在现代临床上二妙散主要用于抗炎免疫的治疗[11-12]。黄敬文等[13]人报道二妙散能够保持Th1/Th2细胞的动态平衡从而改善银屑病的发展。本课题组前期研究发现二妙散水提取物对AA大鼠模型有治疗作用，能明显降低关节炎大鼠病理变化[14]。还有文献报道二妙散在共煎的过程中能促进有效成分的溶出，具有更强的抗氧化作用[15]，所以二妙散在临床应用中具有广阔的前景。但是，关于二妙散的急性毒性研究未见报道，本试验根据最大给药剂量法[16]，将通过灌胃给予小鼠二妙散水提液，评价二妙散的安全性，为二妙散的抗炎免疫调节机制研究及临床应用提供基础资料。

1 材料

1.1 动物

选用SPF级健康适龄昆明小鼠40只，体质量20～22 g，雌雄各半，购于安徽医科大学动物实验中心。实验动物使用许可证号：SCXK(皖)2017—001。小鼠称量体质量后随机分笼饲养，饲养期间自由进食饮水，环境适宜。实验前适应性饲养7 d。

1.2 药物

1.2.1 二妙散水提液的制备

苍术、黄柏中药饮片购自于安徽省草药制品有限公司(安徽省亳州市)。称取苍术、黄柏各200 g，加10倍水浸泡2 h，用武火煮沸后改用文火煎煮1.5 h。再分别以8倍水、6倍水先武后文煎煮1 h、0.5 h，合并3次滤液，浓缩至153 mL，最终生药量为2.613g·mL-1(刚好能自由通过灌胃针头的最大浓度)。密封分装于4 ℃冰箱保存。

1.3 仪器设备及主要试剂

美菱医用冷藏箱(YC-260L，中科美菱低温科技股份有限公司)； 电子天平(mL104/02，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；血液细胞分析仪(希森美康XT4000i);生化分析仪(贝克曼 AU5800)；D-37520低温高速离心机(Thermo scientific，美国)；主要生化试剂购自美国贝克曼库尔特有限公司。

2 方法

2.1 预试验

二妙散水提液组给药剂量为209.04 g·kg-1的小鼠给药后死亡2只，给药量为156.78 g·kg-1的小鼠死亡1只，给药量为130.65 g·kg-1和104.52 g·kg-1的小鼠未见死亡。因为致死率未达70%，而且水提液的药物浓度和给药体积已经达到最大限度。根据毒理学和中药药理实验技术指导，无法测出二妙散水提液的半数致死量(LD50)。因此我们对二妙散水提液进行最大耐受量试验。

2.2 正式试验

2.2.1 最大耐受量试验

取SPF级昆明小鼠40只，雌雄各半。常规饲养一周后随机分为二妙散水提液组和正常对照组并标记称重，每组20只。在禁食不禁水12 h后，水提液组用最大灌胃浓度2.613 g·mL-1，最大灌胃体积0.25 mL·10 g-1给小鼠灌胃，正常对照组灌等量生理盐水。每日2次，间隔8 h，第二次给药前4 h继续禁食不禁水，然后两组进行常规饲养，连续观察14 d。

2.2.2 指标观察及检测

在给药后4 h内密切观察小鼠的死亡情况，4 h稳定之后在试验期间，每天上午和下午分别对小鼠进行观察，并记录试验小鼠的行为活动、外观变化、器官分泌物、大小便、精神状态、呼吸状态和死亡情况；记录给药前1天和给药后第7天、14天的体质量变化；第14天观察结束，禁食不禁水12 h后，摘除小鼠眼球取血，一部分放入抗凝管，用作血常规检测。另一部分放入EP管中，静置3 h后3 000 r·min-1离心15 min，取上清用作血液生化指标检测；解剖小鼠，摘取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，先肉眼观察有无大小、颜色改变，有无结节、肿瘤和坏死现象。再剔除多余的结缔组织，称重后用于计算主要脏器系数，脏器指数=脏器湿重/质量(mg·g-1)；然后将主要脏器用10%福尔马林溶液固定，再用5% HNO3脱钙，石蜡包埋、切片，进行HE染色，用光学显微镜观察各脏器病理组织学变化。

2.3 统计学方法

本试验用SPSS23.0进行统计学分析，在数据资料符合正态分布的情况下，采用均数±标准差表示，组间应用独立样本t检验统计分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 二妙散对小鼠一般生理状态影响

观察表明，水提液组在给药2 h内小鼠精神萎靡，活动和摄食饮水减少。有稀便现象，且大便次数增加。两组口、鼻、眼、耳、均未见异常分泌物。8 h后水提液组小鼠精神状态恢复，活动增加，摄食饮水恢复正常。连续观察14 d，给药组小鼠行为活动、精神状态、呼吸运动、摄食饮水、大小便等情况与正常对照组相比无明显差异，并且观察期间，水提液组和空白组均未见小鼠死亡。

3.2 对小鼠体质量变化的影响

试验期间，分别记录各组小鼠给药前和给药后第7天、14天的体质量。由表1可见水提液组在给药后体质量正常增加，第7天和第14天后的体质量与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

表1 二妙散水提液对小鼠体质量的影响

3.3 对小鼠血常规的影响

收集实验小鼠的血液样本进行血常规检测，由表2可见水提液组的血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)分别与正常对照组相比均差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 二妙散水提液对小鼠血常规的影响

3.4 对小鼠血液生化指标的影响

收集实验小鼠的血清，用全自动生化仪分析谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的含量，如表3所示，水提液组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的含量与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

表3 二妙散水提液对小鼠血液生化指标的影响

3.5 对小鼠主要脏器系数的影响

解剖小鼠，摘取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，先肉眼观察心、肝、脾、肺、肾大小、颜色、有无明显改变。再剔除多余的结缔组织，称重后计算脏器系数，比较各组间脏器系数的变化。由表4可见水提液组小鼠的心、肝、脾、肺、肾系数与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

表4 二妙散水提液对小鼠脏器系数的影响

3.6 小鼠主要脏器病理组织学检测

摘取试验小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要脏器，肉眼可观察到主要脏器大小、颜色、结构均正常。病理组织学切片结果也表明水提液组与正常对照组相比均未见明显病变。说明本试验二妙散水提液对检测小鼠主要脏器没有造成急性损伤，见图1。

注：A.心脏；B.肝脏；C.脾脏；D.肺脏；E.肾脏。图1 小鼠主要脏器HE染色图(×100)

4 讨论

二妙散作为清热燥湿药的基础名方，在临床上对于关节炎、痛风等具有良好的治疗作用。随着现代医学的发展，研究者从细胞水平以及分子生物学角度研究了二妙散对于抗炎免疫的可能作用机制。多种研究证据表明，二妙散以黄柏和苍术1∶1为最佳比例,通过抑制IL-1β、TNF-α等炎症因子的产生从而减轻炎症的发生与发展，机体免疫调节的失衡都会导致炎症因子的产生。虽然二妙散的药用价值高，但中药成分复杂，存在多种生物活性成分，其安全性和毒副作用也备受关注。急性毒性实验是指在24 h内动物接受药物1～2次，观察给药后7～14 d内动物所产生的急性中毒反应[17]。本实验遵循《中药新药研制开发技术与方法》中“中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则”设计了二妙散水提液的急性毒性试验研究。

根据预试验的结果显示二妙散水提液给药量大于130.65 g·kg-1时小鼠出现致死现象，这可能是由于药物浓度过大导致，也提示我们药物共煎过程中可能会产生复杂的化学反应从而会有“增毒、减毒”的作用。最大耐受量结果显示，与正常组比，水提液组在给药2 h内小鼠精神萎靡，活动和摄食饮水减少，出现大便稀薄的现象，且大便次数增加。这可能是由于高剂量的药物对于胃肠道存在一定的刺激。两组眼、耳、口、鼻均未见异常分泌物。8 h后水提液组小鼠精神状态恢复，活动增加，摄食饮水恢复正常。连续观察14 d，给药组小鼠行为活动、精神状态、呼吸运动、摄食饮水、大小便等情况与正常对照组相比无明显差异。水提液组与正常组相比体质量均增加，且无显著性差异(P>0.05)。与正常组相比，两组给药组脏器系数无显著性差异(P>0.05)。进一步对主要脏器病理形态学进行观察，结果显示各组小鼠均未出现由受试药物引起的中毒性的病理改变。血常规和血液生化指标也显示各组间并无显著性差异(P>0.05)。

综上所述，通过二妙散水提液的最大耐受量试验，对昆明小鼠的急性毒性结果显示，试验小鼠在给药量为130.65 g·kg-1时各检测指标均无显著性差异，表明二妙散水提液最大耐受量为130.65 g·kg-1，在大于该剂量时会产生毒性作用。