补肾生血法治疗慢性再障的临床观察及对ICAM-1表达的影响研究

王金环，谷梦宇，于孙婉琪，牛丁忍，孙岸弢，代月*

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；4.中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

再生障碍性贫血(Aplastic anemia AA)[1]是一种骨髓衰竭性疾病，以外周血全血细胞减少以及骨髓有核细胞增生低下为特征，以贫血、感染、出血为主要临床表现。近年来，AA的发病率逐年上升，其病势缠绵，病情较重，给患者造成了巨大负担，因此明确再障的发病机制，找到一条行之有效的治疗方案，对于AA患者尤为重要[2]。众所周知，AA的发病机制主要由3部分[3]所组成：种子学说、虫子学说、土壤学说，即造血祖细胞功能异常；免疫机制的紊乱；造血微环境的异常。根据国内外的最新研究表明，骨髓造血生态位(bone marrow hematopoietic niche,BMHN)的异常是AA发病的核心环节之一[4-5]，而作为骨髓造血生态位的核心环节之一，干细胞的黏附性则逐渐成为了一个新的研究热点。

我们经前期使用补髓生血颗粒治疗慢性再障与整合素β1、β2家族黏附分子的研究，表明信号转导通路的异常与整合素β1、β2家族介导的相关离子通道与信号途径异常密不可分，且可能与免疫超蛋白家族介导的信号通路与离子通道具有一定的联系。而ICAM-1作为一免疫超蛋白家族的一员，是否与慢性再障的发病机制有着一定的联系？这是本次研究需要探讨的内容，基于此，本研究从外周血的角度，探讨使用补髓生血颗粒治疗慢性再障与外周血ICAM-1表达水平的联系，从而为慢性再障的发病机制以及用药方向提供更多的思路与依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入55例2020年1月—2020年4月在黑龙江中医药大学附属第一医院病房及门诊治疗的，符合诊断标准的CAA患者，其中肾阴虚型27例，肾阳虚型28例。肾阴虚型男17例，女10例，患者平均年龄为(41.04±9.27)岁，平均病程为(3.04±1.22)年；肾阳虚型男13例，女10例，患者平均年龄为(42.17±5.86)岁，平均病程为(2.61±0.89)年，两组基础资料比较无显著差异(P>0.05)。同时选取20例健康志愿者作为对照组。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

参照张之南、沈悌等编写的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[6]：①临床表现为发病较急性再障缓慢，贫血、感染、出血症状相对较轻；②血常规检查示血红蛋白下降速度较慢，网织红细胞、中性粒细胞及血小板减低，但未达到重型再障程度；③多部位骨髓穿刺显示三系或两系减少，至少一个部位增生不良。

1.2.2 中医临床诊断标准

参照国家中医药管理局《血液病重点专科协作组慢性髓劳(慢性再生障碍性贫血)的中医诊疗方案(2017版)》[7]：①症状：多有面色白、心悸气短、头晕乏力，脉沉细无力或沉细数；②慢性再生障碍性贫血病史。

1.2.3 中医证候分型诊断标准

参照《中药新药临床研究指导原则(试行)》[8]：①肾阳虚型症状为心悸气短，头晕乏力，面色苍白，口唇、指甲色淡，腰膝酸软，畏寒等，或伴有轻微出血或无出血症状，小便清长，大便溏，舌淡，脉沉细无力或虚大；②肾阴虚症状为心烦，衄血，潮热盗汗，面色苍白，口唇、指甲色淡等，或伴有低热，口渴引饮，小便黄，大便干结，苔薄，舌尖红，脉细数。

1.3 纳入标准

①符合中医、西医临床及中医证候分型诊断标准者；②年龄在18～60岁；③发病后进行西医治疗6个月无意义者；④无心、脑、肾及其他系统严重损害者；⑤已签署知情同意书。

1.4 排除标准

①正处于妊娠、哺乳期；②对试验药物或组成成分过敏者；③患有精神疾病或智力缺陷者；④正在参与其他临床试验者；⑤合并其他血液系统严重疾病或其他恶性疾病者；⑥并发感染或大量失血。

1.5 脱落标准

①治疗过程中并发严重不可控制的并发症，如晕厥、休克等；②转变为重型再障且不可控制者；③未规律服药者。

1.6 治疗方法

1.6.1 基础治疗

①免疫抑制；②促造血治疗；③护肝治疗。

1.6.2 补肾生血治疗

治疗组根据分型不同给与补髓生血颗粒Ⅰ、Ⅱ号方，肾阴虚型使用补髓生血颗粒Ⅰ号方(方含熟地黄20 g，仙灵脾 20 g，五味子20 g，黄芪40 g，红参10 g，山萸肉15 g，枸杞子15 g，桑葚子15 g，补骨脂15 g，菟丝子15 g，女贞子15 g，鸡血藤15 g)，肾阳虚型使用补髓生血颗粒Ⅱ号方(方含附子5 g，黄芪40 g，巴戟天15 g，补骨脂15 g，仙灵脾15 g，鹿茸15 g，红参15 g，仙茅15 g，熟地黄15 g，山药15 g，首乌15 g，枸杞子15 g，鸡血藤15 g)。由黑龙江中医药大学附属第一医院药厂制备成冲剂，每袋15 g，含生药40 g，批准文号：[黑卫药制字(1997)0048号]成人每次1袋，每日3次温水冲服。服药期间嘱患者节饮食、适起居、免作劳，调情志。

1.6.3 支持治疗

若患者治疗期间(1)出现严重出血，输注血小板悬液及相应止血措施；(2)出现严重贫血，应给予输血治疗；(3)出现严重感染，给予抗生素等相应治疗；(4)服药期间尽量避免接种疫苗。

1.7 试验方法和检测指标

1.7.1 试验方法

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗夹心法检测人外周血血清ICAM-1表达水平。

(1)标本采集：嘱治疗组患者及健康志愿者空腹，清晨前往医院，静脉采血3 mL，置于真空采集管，室温状态下自然凝固10～20 min后，以2 500 r/min的频率离心15 min获得血清，吸取1～2 mL离心后血清置于离心管并放于低温冰箱内存贮。

(2)检测流程：①设空白孔及样品孔，空白孔不添加酶标试剂②；在酶标包被板上进行标准品的稀释与加样；③封膜后于37 ℃环境下进行温育，时间为30 min；④使用稀释后的洗涤液洗涤5次；⑥再次加酶、温育并洗涤；⑦加入显色剂，避光显色；⑧在450 nm的波长下使用酶标仪测量吸光度，使用计算机进行数据处理与分析。

1.7.2 检测指标

对入组患者治疗前后及志愿者外周血血清中的ICAM-1表达水平进行检测。

1.8 统计学方法

采用SPSS25.0软件处理数据，若符合正态分布且为计量资料，采用t检验，组内比较用配对t检验，组间比较用独立样本t检验，用χ2检验检验计数资料，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效

脱落后(脱落原因：未规律服药)治疗组患者共50例，其中临床治愈6例，占12%；显效21例，占42%；有效18例，占36%；无效5例，占10%，临床总有效率为90%，提示使用补肾生血之补髓生血颗粒对慢性再障患者有较好的临床疗效。比较两证型的临床总疗效Z值为-2.019(P<0.05)，差异有统计学意义，提示肾阳虚的临床总疗效优于肾阴虚型，这与朱丹溪的“阳虚易治，阴虚难调”理论不谋而合，见表1。

表1 慢性再生障碍性贫血患者两证型临床总疗效比较[例(%)]

2.2 中医症状积分比较

治疗组两型患者治疗后中医证候总积分组内比较Z值为-4.562和-4.217，差异有统计学意义(P<0.05)；肾阴虚型与肾阳虚型进行组间比较Z值为0.675，差异有统计学意义(P<0.05)。说明补髓生血颗粒可以改善慢性再障患者的中医证候积分，且肾阳虚型优于肾阴虚型，见表2。

表2 慢性再生障碍性贫血患者中医证候总积分对比分)

2.3 外周血ICAM-1表达水平比较

使用LSD检验进行两证型患者治疗前ICAM-1的表达水平分析，P=0.927>0.05，差异无统计学意义；治疗前治疗组两证型与健康对照组分别比较，P<0.001，差异有统计学意义；治疗后两证型、两证型与对照组相比较，P=0.032<0.05、P<0.001，差异有统计学意义。提示补髓生血颗粒能改善慢性再障患者外周血黏附分子ICAM-1的表达水平，且肾阳虚型改善程度优于肾阴虚型，可用于预测患者预后，见表3。

表3 慢性再生障碍性贫血患者两证型治疗前后外周血ICAM-1表达水平对比

3 讨论

对于再障的治疗方面，近年来西医多采用造血干细胞移植、免疫抑制、促造血治疗以及输血等支持疗法，但其副作用较大且较为昂贵，多不被患者所接受；而作为传统文化的瑰宝，中医传统思想认为，髓为肾之所化，正如《内经》所云：“肾主骨生髓”，且“精血同源”，故现代中医医家们多将慢性再障之发病之根定位于肾，采用补肾生血法进行治疗，并在补肾法的基础上分支为不同流派。如团队学术带头人孙伟正教授主张补肾生血养髓法，以肾为核心；高萍教授等[9]则主张采取补益脾肾之法治疗再生障碍性贫血；梁冰教授等[10]强调除补益脾肾法之外，亦要重视补益肝肾；以上诸位医家或从肾出发，或从脾肾出发，或从肝肾论治，无论哪种疗法，均取得了并且取得了不错的临床疗效[11]。故本研究仅选取肾虚型再障患者加以试验研究。另一方面，补髓生血颗粒为团队带头人孙伟正教授的有效经验方，孙教授团队针对此药物的前期试验研究充足，已经有效的证明了其有效性及科学性[12-14]，且设置健康对照组，有利于探析健康人与再障患者细胞间黏附分子表达水平的差异，从而进一步分析细胞间黏附分子与再生障碍性贫血发病机制之间的联系，故本次课题研究采用健康对照组进行对照研究。

补髓生血颗粒是国家级名中医孙伟正教授的有效经验方，本方以补肾填精养血为总体治疗大法，以六味地黄汤为底方进行加减化裁。方中熟地黄为君，补肾填精；配合山萸肉为臣，增强补肾生血之功效，同时利用山萸肉收涩之特点行以固摄，从而使肾精补而不散；方中还添加鹿茸之血肉有情之品用于益精血、填筋骨；佐以人参、黄芪、枸杞等大补气血，气血双补从而相互为用；值得一提的是，方中除补肾养血之底方外，还依据现代药理学的进展添加了相关药物，如调解机体免疫之猪苓[15-17]、白花蛇舌草[18]，升血小板与白细胞之鸡血藤[19]，真正做到了中医传统文化与现代医学的结合，从而古今并用显奇效。

正如植物的茁壮生长依赖于肥沃的土地一样，骨髓造血细胞的正常发育同样也离不开一个好的造血微环境，而作为骨髓造血微环境的重要组成部分，骨髓基质细胞是由骨髓间充质干细胞所组成的，骨髓间充质干细胞又可分泌多种造血因子，为造血干细胞的正常增殖分化提供重要的营养支持。ICAM-1作为一种细胞间黏附分子，是细胞膜表面的糖蛋白，广泛存在于造血与非造血组织中，其中在血管内皮细胞膜表面的表达水平最高[20]。整合素LFA-1为ICAM-1的配体，在细胞黏附作用的发生过程中，配体与受体相互作用，调控骨髓基质细胞与骨髓造血干细胞之间的黏附性，从而起到调控造血干细胞迁移与黏附的作用[21]，控制着整个造血生态位中的稳定与平衡。此外，有研究表明，抗ICAM-1抗体能破坏造血干细胞在骨髓基质细胞上聚集成堆，影响造血干细胞的归巢[22]。综上可见，ICAM-1可以介导造血干细胞归巢[23]，并可有效增强骨髓间充质干细胞与骨髓造血干细胞之间的黏附性，是骨髓造血生态位的调节因子[24]。本次使用补髓生血颗粒治疗慢性再障的外周血ICAM-1表达水平对比发现，治疗组治疗前后相比，患者治疗后的ICAM-1表达水平明显低于治疗前；治疗前治疗组与对照组相比，慢性再障患者ICAM-1的表达水平明显低于健康志愿者；治疗后治疗组与对照组相比，慢性再障患者ICAM-1的表达水平仍然低于健康志愿者。提示慢性再障患者的外周血ICAM-1表达水平低于正常人，使用补肾生血法之补髓生血颗粒治疗慢性再障，能够有效地提高其外周血ICAM-1表达水平，具有较好疗效。

综上所述，使用补髓生血颗粒治疗慢性再障能改善其临床症状，提升外周血血象，增强外周血ICAM-1表达水平，且阳虚型疗效优于阴虚型，可用于预测慢性再障患者的预后。补髓生血颗粒在提升外周血ICAM-1表达水平治疗慢性再障上，可能是以下两种机制：(1)通过增强骨髓间充质干细胞与骨髓造血干细胞黏附性，介导造血干细胞归巢等方面来改善骨髓造血生态位；(2)通过促进黏附分子的表达，从而促使骨髓间充质干细胞分泌更多的造血因子，纠正骨髓造血。提示慢性再障的发病机制可能与外周血ICAM-1的异常表达相关，纠正异常表达的黏附分子，这可能是慢性再障的一种新型治疗思路。