顶空气相色谱法同时测定药物洗脱支架中丙酮和乙酸乙酯的残留量

王艳培(乐普(北京)医疗器械股份有限公司，北京 102200)

0 引言

冠心病是当前一类严重威胁人类生命健康的疾病类型。当前在我国本病的患病率、死亡率均在不断升高，针对本病的治疗方法及效果受到人们的关注和重视[1]。自1977年起，经皮冠状动脉腔内血管成形手术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)在冠脉支架狭窄疾病治疗中得到应用。当前已相继对该技术进行了3次技术革命，主要为裸金属支架、药物洗脱支架以及生物可吸收支架。裸金属支架和药物洗脱支架的主要区别是药物洗脱支架是在裸支架的表面涂上特殊的药物涂层支架[2]。植入到血管里后支架上药物涂层能控制药物缓慢释放，进而阻止瘢痕组织过度增生。与传统金属裸支架相比，药物洗脱支架可以减少支架内再狭窄的发生。目前，药物洗脱支架主要以紫杉醇和雷帕霉素作为主要药物成分。涂层技术类型有聚合物载体支架、单面刻槽技术、全降解涂层及无聚合物载体支架。在血管内药物洗脱支架药物涂层研究过程中发现，为解决药物洗脱支架药物涂层控释和涂层牢固度等性能时，需要使用多种有机溶剂对聚合物涂层和药物进行优化。公司某款药物洗脱支架在进行喷涂过程中需应用溶剂丙酮和乙酸乙酯分别对聚合物涂层和药物涂层进行喷涂工艺。为减少药物涂层中残留溶剂对人体损害，该药物洗脱支架必须建立残留溶剂分析方法，以对支架的丙酮和乙酸乙酯进行检测，确保药物洗脱支架中残留溶剂符合标准要求[3]。本文主要以通过实验建立药物洗脱支架中残留溶剂分析方法及对药物洗脱支架中丙酮和乙酸乙酯残留量进行检测分析。

仪器和设备：安捷伦7890A气相色谱仪，配置氢火焰离子化检测器(安捷伦科技有限公司)，Auto-HS顶空进样器(成都科林科技有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多公司)，涡旋混合振荡器(IKA公司)，丙酮和乙酸乙酯标准品，购自Accustandard，纯度99.5%，1 mL，Gilson5.0 mL移液枪，大龙1.0 mL移液枪，实验用水为去离子水。

1 实验内容

1.1 实验条件

HP-INNOWAX 色谱柱 (30 m×320 μm×0.5 μm)；柱温 (采用程序升温)：25 ℃ (2 min)—30 ℃/min—100 ℃(2 min)；进样口温度：150 ℃；检测器温度：250 ℃；氮气：28.2 mL/min；氢气：40 mL/min；空气流量为 400 mL/min；分流比：20∶1；柱流速：1.2 mL/min；顶空平衡温度：80 ℃；平衡时间：30 min。

1.2 标准溶液制备

取外部干燥的50 mL容量瓶，加入约20 mL去离子水，加瓶塞，精确称重。分别精确称取50 mg丙酮和乙酸乙酯标准品于容量瓶中，每次称量完毕都轻轻摇匀溶液，盖好瓶塞进行称重。前后两次称重之差为溶液中含丙酮和乙酸乙酯的质量。加水至容量瓶的刻度容量线处，盖好瓶塞，摇匀即配制成丙酮和乙酸乙酯浓度分别为962 μg/mL和1 069 μg/mL作为标准储备液。

1.3 样品的制备

称取喷涂后的药物洗脱支架0.10 g，中间剪碎，转移并置于顶空瓶中，用移液枪精密加入2 mL去离子水，用顶空瓶盖压紧密封，备用。

1.4 丙酮和乙酸乙酯残留量的计算

药物洗脱支架中丙酮和乙酸乙酯残留量的计算方法按照外标标准曲线法进行计算。

2 方法学验证

2.1 专属性试验结果

由于丙酮和乙酸乙酯均具有较低的沸点，色谱柱对两种溶剂保留差异不大。通过调节降低进样口温度和较低柱温的程序升温提高丙酮和乙酸乙酯的分离效果。实验发现按照1.1所述的实验条件丙酮和乙酸乙酯能够实现良好的分离。丙酮和乙酸乙酯之间的分离度大于1.5。

取去离子水2 mL于顶空瓶中，加盖密封，进行空白实验；取未喷涂药物涂层的药物洗脱支架按照1.3制备，加2 mL去离子水，加盖密封，进行阴性对照实验；取丙酮和乙酸乙酯标准混合溶液一份，2 mL于顶空瓶中，加盖密封，进行专属性实验，按照1.1所述的实验条件进行测试，记录色谱图。结果显示，空白实验和阴性对照实验在丙酮和乙酸乙酯色谱峰处均无干扰，丙酮和乙酸乙酯两种组分分离良好。丙酮保留时间为3.54 min，乙酸乙酯的保留时间为4.46 min。色谱图如图1所示。

图1 丙酮和乙酸乙酯专属性色谱图

2.2 系统适应性试验

按照2.1中的方法丙酮和乙酸乙酯标准混合溶液浓度制备6份标准溶液，分别移取2 mL于顶空瓶中，顶空瓶盖压紧密封。按照1.1所述的实验条件进行系统适应性试验。结果显示，丙酮和乙酸乙酯拖尾因子均小于1，丙酮理论塔板数大于28 000，乙酸乙酯理论塔板数大于36 000，丙酮和乙酸乙酯分离度大于10。系统适应性试验结果如表1所示。

表1 系统适应性实验结果

2.3 线性范围

取丙酮和乙酸乙酯标准储备液分别制备一系列不同浓度混合标准工作溶液，其中丙酮和乙酸乙酯混合标准工作液浓度均依次为 50、100、200、500、1 000 μg/mL。

分别取混合标准系列工作溶液2 mL于顶空瓶中，加盖密封。按1.1项下色谱条件进样，分别记录丙酮和乙酸乙酯的峰面积，按照浓度-峰面积绘制工作标准曲线，丙酮和乙酸乙酯线性回归方程和相关系数如表2所示。

表2 丙酮和乙酸乙酯线性回归方程和相关系数

2.4 精密度试验

根据2.2中的实验结果，分别记录丙酮和乙酸乙酯色谱峰面积，分别计算丙酮和乙酸乙酯的精密度。丙酮和乙酸乙酯RSD分别为1.50%和1.66%(n=6)。丙酮和乙酸乙酯精密度检测结果如表3所示。

表3 丙酮和乙酸乙酯精密度检测结果

2.5 检测限(LOD)与定量限(LOQ)实验

取2.3项中丙酮与乙酸乙酯浓度为50 μg/mL混合标准溶液，不断稀释，直到丙酮和乙酸乙酯的检测限(LOD)与定量限(LOQ)试验接受标准分别为：在丙酮和乙酸乙酯的LOD溶液的色谱图中，主峰与噪音峰信号的强度比约为3 (且应不得小于3)；在丙酮和乙酸乙酯的LOQ溶液的色谱图中，主峰与噪音峰信号的强度比约为10 (且应不得小于10)。丙酮与乙酸乙酯检测限和定量限结果如表4所示。

表4 丙酮和乙酸乙酯检测限(LOD)和定量限(LOQ)结果

2.6 加样回收率试验

分别精密称取已知丙酮和乙酸乙酯残留量的药物洗脱支架0.10 g，共9份置于顶空瓶中，分别加入相当于药物洗脱支架上丙酮乙酸乙酯残留量的80%、100%和120%各3份的丙酮和乙酸乙酯混合标准溶液，用去离子水补充至2 mL。按1.1的色谱条件进行测定，按照1.4的计算方法进行计算。丙酮80%、100%和120%三个浓度平均回收率分别是：95.64%、96.95% 和 99.35%，RSD=1.97%；乙酸乙酯80%、100%和120%三个浓度平均回收率分别是：93.97%、97.80% 和98.37%，RSD=2.45%。

2.7 样品测定

取完成喷涂后的药物洗脱支架样品，即刻密封于样品瓶中。按1.3项样品制备方法进行制备3份样品供试品，按照1.1项的色谱实验条件进行测定，按照1.4项的计算方法计算丙酮和乙酸乙酯残留量，结果显示丙酮平均残留量为1 273.5 μg/g，乙酸乙酯平均残留量为 2 358.1 μg/g。

3 总结

3.1 方法建立

本文建立了同时检测药物洗脱支架中丙酮和乙酸乙酯两种低沸点、挥发性溶剂的方法。丙酮和乙酸乙酯均含有不饱和基团，在低波长有紫外吸收，但由于分子量小，很难在液相色谱上保留，液相色谱难以检测。《中国药典》通则溶剂残留测定法对丙酮和乙酸乙酯有指导方法，应该优先选择气相色谱法。丙酮沸点56.5 ℃，乙酸乙酯沸点77.2 ℃，如果采取气相直接进样的方法，沸点接近较难分离，且进样溶液的溶剂，难以选择、易对两种组分干扰，影响检测结果。采取柱温程序升温、降低进样口温度，可以有效增强两种组分在色谱上的保留，增加分离效果。采取顶空进样法，去离子水作为浸提溶剂，浸提充分，且氢火焰离子化检测器对水没有响应，有效避免了溶剂对组分的干扰，增加了残留溶剂检测的专属性。

3.2 方法线性范围

本文中建立丙酮和乙酸乙酯残留量的检测方法在很宽的范围内都具有良好的线性。丙酮线性范围为48.1～962.3 μg/mL，乙酸乙酯线性范围为53.5～1 069.2 μg/mL，可以保证检测因为工艺波动引起溶剂残留量的变化。实际药物洗脱支架在经过喷涂、预装、包装、灭菌和解析等生产过程中，丙酮和乙酸乙酯检测浓度很少达到500 μg/mL。后续应对方法线性范围进行优化，缩小残留溶剂方法线性范围，增加残留溶剂检验方法的准确性。

3.3 样品检测

本文中样品检测为药物洗脱支架完成喷涂药物涂层工艺后，即刻将样品密封于样品瓶中。检测结果显示丙酮残留量为 1 273.5 μg/g，乙酸乙酯为 2 358.1 μg/g。该产品成品技术要求规定的丙酮要求为500 μg/g，乙酸乙酯为5 000 μg/g。即药物涂层即刻喷涂完成后丙酮残留量不符合要求，而乙酸乙酯符合要求。实际该产品在药物涂层喷涂工艺验证过程中，喷涂后的支架放置一定时间后进行检测，丙酮和乙酸乙酯残留量合格后完成喷涂验证工艺工作。后续的研究中应建立该产品丙酮和乙酸乙酯残留量释放曲线，根据验证释放曲线，确定丙酮和乙酸乙酯残留量合格的释放天数，减少喷涂后的检验工作，确定优化该产品的喷涂工艺验证方案。

4 结语

目前药物洗脱支架在冠心病PTCA手术治疗领域得到了广泛的应用，临床上有建立支架中残留溶剂分析方法，对丙酮和乙酸乙酯含量进行检测的要求[4]。本文中建立并考察了生物支架中残留溶剂分析方法。结果发现，药物洗脱支架丙酮和乙酸乙酯残留量测定方法的准确性高、可靠性好且具有较好的重复性，其系统适应性、专属性、LOQ、LOD、线性、精密度和准确度等实验结果均符合规定要求。故研究认为，本方法可作为药物洗脱支架的丙酮和乙酸乙酯残留量的一项准确、可靠的检测方法。同时，研究中也发现一些不足之处，包括喷涂溶剂发生改变时需再验证，残留溶剂的释放曲线需要进一步验证，以及方法线性范围需要优化。在后续研究中，仍需药物洗脱支架中残留溶剂的分析方法进行进一步的研究。