细胞衰老在卵巢癌治疗方面研究进展

沈宏，周子路，王彩霞，陶逸萍，郭燕君

（嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001）

1 细胞衰老机制

1961年，Hayflick 和 Moorehead 首次研究了细胞水平上增殖的永久停滞，他们表明原代人类细胞的寿命仅限于大约 60 个分裂。最近，已经有关于选择性消除衰老细胞和随后的组织再生或缓解疾病症状的研究[1]。衰老目前被定义为响应内在或外在因素的细胞状况，包括致癌基因激活、氧化应激、线粒体功能障碍、辐射和暴露于化疗药物。衰老的早期阶段是响应这些刺激中的一种或多种而开始的。在这个阶段，衰老细胞发生特征性的形态变化，变得扁平和扩大。这一过程伴随着核染色质重塑和核纤层蛋白 B1 的丢失，线粒体中氧化代谢的诱导，以及衰老细胞抗凋亡途径 (SCAP) 的激活，使细胞对死亡具有抵抗力。由于溶酶体活性的增加，还观察到衰老相关的β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal），并诱导衰老相关的分泌表型（SASP）。自噬是在应激刺激促进生物体内平衡后，细胞中的溶酶体降解受损大分子或细胞器的过程。它可能与细胞凋亡和衰老有关。

2 细胞衰老生物标志物

衰老细胞具有多种形态和生化特征，可用于体外和/或体内检测。因为没有单一的标记以明确识别衰老细胞，所以通常使用标记和分析技术的组合来提高检测的特异性。衰老细胞通常大而扁平，这些形态特征可以使用光学显微镜或流式细胞术 (FC)来观察。其他常用于检测衰老细胞的技术包括免疫荧光 (IF)、免疫组织化学 (IHC)、蛋白质印迹 (WB)、报告基因检测、染料掺入、酶染色、PCR（聚合酶链式反应）、FISH（荧光原位杂交）和ELISA（酶联免疫吸附试验）。最合适的检测方法将取决于研究的目标和选择的衰老模型。

第一组主要的衰老标志物由与衰老细胞结构变化相关的标志物组成。除了前面提到的细胞大小和形状的变化外，衰老通常伴随着溶酶体活性的增加，这可以通过酶染色检测到。一种特别值得注意的与衰老相关的溶酶体酶是衰老相关的 β-半乳糖苷酶（SA-β-半乳糖苷酶），其最适 pH 值为 6.0。长期以来，SA-β-gal 是检测衰老细胞的金标准，但最近的研究对其特异性提出了担忧。例如，SA-βgal 在神经元中具有活性并在发育中的胚胎中表达，但这些观察结果均不被认为与衰老有关。因此，虽然 SA-β-gal 活性与衰老和细胞增殖状态密切相关，但它仍然被广泛使用，因此不能认为 SA-β-gal 活性足够特异性以单独识别衰老细胞。另一个经常被利用的衰老标志是 SA-α-岩藻糖苷酶活性，随着衰老过程中溶酶体的活化而增加。重要的是，它的上调可能比 SA-β-gal 更具特异性。另外可用作衰老标志物的是脂褐质——一种黄褐色残留物，由溶酶体中不完全降解或代谢的脂质组成——它会在衰老组织中积累。它的存在可以使用光学显微镜、利用其自发荧光或苏丹黑 B (SBB) 染色来检测。最近还报道了一种新的生物素缀合的 SBB，用于灵敏的脂褐质检测 (GL13)，可以使用特定的抗生物素抗体进行可视化。另一类敏感的衰老指标由 DDR 基因产物组成，其表达通常通过免疫荧光可视化。最常用的 DDR 蛋白是在 Ser-139 处磷酸化的γH2AX，它在双链 DNA 断裂位点积累并能够检测双链断裂 (DSB) 修复途径蛋白。

属于 p16/RB 和 p53/p21 衰老诱导途径的蛋白质也是常见的衰老标志物。特别是，p16INK4a、pRB、磷酸化-pRB 或 p21、p53 和磷酸化-p53 的过表达可以通过 WB、IHC 和/或 IF 来确定。这些途径中鲜为人知的分子，如 DEC1 和 PPP1A，也已被确定为潜在的生物标志物。DEC1 是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，可介导 p53 依赖性过早衰老，而 PPP1A 是 PP1α 的催化亚基，在癌基因诱导衰老 (OIS) 期间在 p53 介导的途径中具有活性。

与SASP相关的细胞因子分泌，其特点是促炎化合物的广泛分泌。SASP 因子分泌到组织微环境中是在损伤或癌基因诱导的衰老过程中诱导的，并且可以通过 WB、ELISA 或 SASP 特异性测定来检测。在最近的出版物中已经讨论了几种 SASP 相关化合物和结构的检测，但仅基于这些标记物确认衰老是非常具有挑战性的，并且获得的结果可能会产生误导，因为这些物质也在某些条件下由非衰老细胞分泌。衰老细胞分泌的常见 SASP 因子包括信号分子，如白细胞介素（如 IL-6 和 IL-8）、膜阴影粘附分子和其他生长因子。

3 细胞衰老在卵巢癌治疗中的作用

在最近的研究中，已经证实诱导肿瘤细胞衰老以防止肿瘤细胞的无限增殖可以成为一种重要的治疗方法。正常细胞积累了癌基因应激、氧化应激和DNA损伤的变化，这些变化触发了细胞异常增殖的初始阶段。这种异常的增殖可以引起癌前病变；与这种异常情况相平行的是，卵巢癌细胞的内在故障安全机制，如衰老和凋亡被激活。在卵巢癌的进展过程中，损伤的积累推翻了这些保护机制，导致了卵巢癌的发生。实验研究证实，化疗和放射治疗等常规治疗方法可以诱导细胞衰老；同时，针对卵巢癌的靶向生物治疗的研究也取得了一定的进展。化疗、放射治疗和生物治疗导致的细胞衰老永久地阻止了生长。在癌细胞中，化疗诱导的衰老是一种重要的细胞命运的替代[2]。该研究报告了在癌症中不依赖凋亡的p53功能，并表明过度表达Bcl-2的小鼠淋巴瘤化疗的机制是通过由p53和p16INK4a控制的衰老程序而不是通过凋亡[3]。 相反，有文献报道，DNA 甲基转移酶（DNMT）DNMT3a在阿霉素诱导的结直肠癌细胞衰老和凋亡之间切换中发挥重要作用，DNA损伤药物阿霉素（Dox）诱导细胞衰老，其浓度明显低于诱导细胞凋亡所需的浓度。在Dox低浓度下，肿瘤抑制因子p53被激活，被激活的p53增强p21的表达。在Dox高浓度下，Dox激活p53导致细胞凋亡而不增强p21表达。控制Dox诱导衰老和细胞凋亡的差异效应的潜在机制和因素尚不清楚。DNMT3a被Dox上调，特别是在诱导HCT116结直肠癌细胞凋亡的浓度下，这个过程受到p53的调节。同时，p21的表达在诱导衰老的浓度下显著上调，并且在使用诱导凋亡的Dox浓度进行处理时保持较低水平。DNMT3a和p21对Dox的差异表达表明，DNMT3a可能是Dox诱导的衰老和细胞凋亡之间切换的关键因素。此外，当DNMT3a沉默时，用诱导凋亡的Dox浓度处理HCT116细胞增加了发生衰老的细胞的百分比，伴随着p21的上调。相反，诱导衰老的Dox浓度促进了细胞凋亡率，p21表达受到抑制。令人惊讶的是，在Dox的两个范围内都没有检测到p21启动子的DNA甲基化状态的变化[4]。当衰老细胞受到依赖于P53的凋亡刺激时，它们会因治疗而发生坏死[5]。有趣的是，卵巢癌细胞衰老的激活与强烈的衰老相关分泌表型(SASP)有关，SASP可以吸引和激活免疫系统细胞来改变卵巢癌的微环境。关于免疫功能障碍，SASP的促炎性质可以招募免疫细胞，免疫细胞可以杀死和清除衰老细胞或其他存活的癌细胞[6]。总而言之，可以探索化疗、放射治疗和生物治疗诱导的细胞衰老作为卵巢癌的替代或补充治疗。

3.1 细胞衰老与卵巢癌化疗

卵巢癌最常用的治疗方法是手术辅助化疗，但这些方法很难显著延长5年生存率(约20%)[7]。尤其是卵巢癌的化疗耐药性和较强的侵袭转移能力，严重降低了卵巢癌患者的远期疗效和生存率。卵巢癌化疗主要是通过诱导卵巢癌细胞凋亡来治疗的。但是，肿瘤细胞普遍存在凋亡障碍，卵巢癌治疗的一大难题是肿瘤细胞凋亡抵抗。随着研究的深入，研究证实化疗药物可以诱导肿瘤细胞衰老。衰老的细胞处于永久性生长停滞状态，修复DNA损伤后，仍然经历细胞周期停滞。化疗可以诱导细胞周期停滞和衰老，但细胞周期停滞不是衰老的同义词。一种类型的静止是简单的静止，一种可逆的停止。细胞停滞是因为缺乏生长因子，而添加生长因子会导致增殖。另一种类型的静止是锁定静止，一种不可逆转的停顿。分化的细胞被踩刹车，过度的刺激导致衰老。许多研究发现，低剂量的化疗药物可以导致肿瘤细胞衰老，并进一步证明，诱导肿瘤细胞衰老是逆转耐药性的可行策略。诱导衰老的化疗，一方面可以减少化疗的剂量；研究表明，低剂量的化疗药物可诱导A2780卵巢癌细胞衰老，导致细胞周期延长，主要停滞在细胞周期的G1期[8]。此外，根据Schmitt’s小鼠化疗研究发现，化疗药物可引起肿瘤细胞发生衰老变化，而细胞衰老的机制直接影响化疗效果，衰老细胞的表达量与预后密切相关。目前认为化疗药物诱导的细胞周期停滞与DNA损伤直接相关。如果小剂量化疗药物引进无法修复的DNA损伤，卵巢癌细胞往往会发生衰老，而不是细胞凋亡。因此，衰老在体内对化疗的反应中起着重要作用。

3.2 细胞衰老与卵巢癌放射治疗

在卵巢癌中，放射治疗在卵巢癌治疗中的应用较少，手术和化疗仍然是肿瘤基本的治疗方法。卵巢癌肿瘤对放射敏感；放射治疗目前并不是卵巢癌的主要治疗方法，放射治疗只作为肿瘤手术后的辅助治疗，卵巢癌晚期及复发病变的姑息治疗方法。迄今为止，许多研究证实放射治疗对卵巢癌具有治疗效果。

在上皮性卵巢癌中，放射治疗可以用来缓解晚期卵巢癌引起的疼痛、出血或压迫症状[9]。Yahara等人选择了27名完全缓解后有限复发的患者，评估了确定性放射治疗对上皮性卵巢癌复发的疗效和毒性。他们发现，放疗对复发性上皮性卵巢癌的局部控制率较好，且无严重毒副作用[9]。Wei也证实放疗联合化疗对铂耐药复发性上皮性卵巢癌有良好疗效[10]。Albuquerque等报道，长期随访证实了介入野放射治疗对局部复发卵巢癌的益处[11]。在卵巢透明细胞癌中，放疗可以提高早期(ⅠC期和Ⅱ期)患者5年的无瘤生存率20%(相对风险为0.5)[12]。Macrie等人评估了盆腔放疗在卵巢透明细胞癌中的作用。他们发现，这种疾病的患者在手术和化疗后表现出盆腔复发的倾向，而且盆腔放射治疗可以有效地杀菌微观肿瘤细胞，并提示盆腔放射治疗可能使卵巢透明细胞癌患者受益[13]。

众所周知，提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性是放射治疗成功的关键。一些数据表明，大规模辐射(X射线)可以诱导肿瘤细胞衰老，并进一步改变肿瘤细胞对X射线的敏感性。Penha等人报道，不同剂量和时间的辐射暴露对肿瘤细胞的影响不同[14]。由于衰老在抗癌策略中发挥着越来越重要的作用，诱导衰老的放射治疗已广泛应用于甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌等[15]。虽然诱导衰老放射治疗发展迅速，但这一疗法在卵巢癌治疗上尚未广泛应用，希望这一新疗法能为卵巢癌的治疗提供一种有用的工具。

3.3 细胞衰老与卵巢癌生物治疗

与传统的化疗和放射治疗不同，生物治疗可以显著延长患者的生存时间，而不会出现很大的不良反应。因此，恢复衰老途径、诱导肿瘤细胞衰老是一个很有前景的治疗新靶点。有一些研究不仅在卵巢癌细胞系中提供了衰老特征的证据，而且在标本中也提供了证据。在Konecny等人的研究中，他们发现p16在原发临床卵巢癌标本中的过度表达可能导致衰老[16]。Mikuaapietrasik等人[17]表明，SA-A-Gal在诱导衰老的卵巢癌转移标本中的表达显著增加。

在基因治疗方面，Bitler等人首次证明Wnt5a的激活通过促进组蛋白细胞周期调节因子/早幼粒细胞白血病衰老途径来诱导人上皮性卵巢癌细胞衰老。Wnt5a的不同表达与上皮性卵巢癌患者的不同肿瘤分期和总生存期有关。这些数据与Wnt5a信号促进人卵巢癌细胞衰老是一种潜在的卵巢癌治疗新策略的观点是一致的[18]。Pan等研究发现Daxx缺失可以以p53/p21依赖的方式加速小鼠卵巢表面上皮细胞的衰老，并诱导DNA损伤相关蛋白(p-H2AX和p-Chk2)和细胞周期相关基因(p21和p27)的高表达。这些结果提示DAXX可能在上皮性卵巢癌的发生发展中起作用，并可能成为抗癌的靶点[19]。Aird等人发现，上皮性卵巢癌细胞株和标本中核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)的表达显著高于正常对照，并且RRM2的表达下调通过细胞衰老机制抑制了人上皮性卵巢癌细胞的生长。这些数据表明，抑制RRM2诱导衰老是上皮性卵巢癌患者的一种新的治疗策略[20]。