脑瘫共患癫痫患儿肠道菌群的组成及功能分类研究

温壮飞,李发龙,蔡青桐,林 野,朱 彬,邰先韬

(1.海口市妇幼保健院儿童康复科,海南 海口 570000;2.昆明中医学院康复教研室,云南 昆明 650000)

脑瘫(cerebral palsy,CP)是一种异质性疾病,也是儿童残疾常见的原因,具体表现为运动和姿势发展的永久性障碍导致的活动受限。CP是患儿在胎儿或婴儿期大脑发育过程中出现的非进行性脑损伤[1-3]。CP通常伴随其他并发症,如感觉、知觉、认知、交流和行为障碍,以及癫痫和继发性肌肉、骨骼等问题。癫痫和CP之间存在着密切的关系。CP患儿中癫痫发生率为25%～45%,远高于新生儿中0.1%～0.3%的发病率[4-5]。脑瘫共患癫痫(cerebral palsy and epilepsy,CPE)会显著加重CP患儿的脑损伤。临床上通常选用抗癫痫药物或饮食方案(如生酮饮食)对CPE患儿进行治疗[6]。然而有研究表明,在使用抗癫痫药物治疗后,患儿出现了严重的认知发育障碍,包括注意力[7]、记忆力[8]、语言功能障碍[9]等;生酮饮食则会因患儿个体差异而表现出不同的疗效[10]。

肠道菌群(gut microbiota,GM)在人类健康中发挥着核心作用,其能够刺激免疫系统并对潜在病原体表现出定植抗性。GM包含的基因是人类基因组的150倍[11],参与了多种酶促反应,产生了如维生素和短链脂肪酸类促进健康的代谢物。近年来,微生物-肠-脑轴的概念与研究在生物医学界受到了极大的关注。GM与大脑可以通过中枢和肠道神经系统及内分泌、免疫、代谢途径进行双向交流[12]。已有研究表明,GM会影响中枢神经系统,从而影响人的行为、认知、情绪及焦虑和抑郁状态。GM失调与多种神经系统疾病有关,例如自闭症[13]、多发性硬化症[14]、帕金森病[15]和阿尔茨海默病[16]。GM为治疗CPE提供了一条全新的思路[17]。

目前,虽然有GM治疗各种单一神经系统疾病的研究,但鲜见其在CPE患儿中的特征调查及深度研究。本文对27名CPE患儿和21名健康儿童进行对照研究,探讨CPE患儿的GM特征,以期提高对GM在CPE发病及进展机制中作用的认识,并为CPE患儿的GM干预治疗提供理论铺垫。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

于2021年11月至2022年5月在海口市妇幼保健院招募27名3～18岁CPE患儿为实验组,选取同期在院进行体检后无任何异常的21名3～18岁健康儿童为对照组。

纳入标准:

实验组:①年龄为3～18岁;②根据《新诊断患儿癫痫的初始单药治疗专家共识》[18]和《国际专家建议:需立即转诊进行脑性瘫痪诊断评估的临床特征》[19]诊断为CPE;③患儿有明确的CPE临床表现。对照组:①年龄为3～18岁;②体检后无任何异常。

排除标准:

①有过敏史,如食物过敏、特应性皮炎和哮喘;②有遗传性疾病,如地中海贫血、遗传性耳聋和苯丙酮尿症;③有代谢性疾病,如肥胖症、糖尿病和类风湿性关节炎;④在收集粪便样本时的前2个月内曾接触过抗生素、益生菌或质子泵抑制剂。

本文属于横断面调查研究,经海口市妇幼保健院伦理委员会批准(注册号为院[2021]01011)。所有入组儿童家属均提供书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本的采集和检测

参考有关临床指南[20],在临床检查中,使用样本拭子收集实验组和对照组儿童的新鲜粪便样本,并将其保存在消毒管中;确保在30分钟内将粪便样本转移到-80℃冰箱中进行长期储存。严格按粪便DNA抽提试剂盒说明书进行操作,从粪便样本中分离DNA。

将DNA样本送到广东美格基因科技有限公司进行测序,使用PCR扩增试剂盒,用338F和806R引物扩增16S rRNA的超变异V3～V4区域;然后,将PCR产物制备成测序文库,并由MiSeq平台(Illumina,San Diego CA,U.S.A.)测序为300(nt)配对端读数。剩余的DNA和粪便样本保存在-80℃的冰箱中。

1.2.2 测序注释和质控

参照有关参考文献[21]的方法,按照以往描述对原始数据进行过滤。基于至少50个碱基的重叠,过滤后样品的reads进行拼接,得到的拼接序列为原始Tag数据。经过过滤去除低质量和不符合长度的Tag后得到高质量的Tag数据(clean tags);并通过USEARCH(v7.0.1090)软件将clean tags聚类为相似度97%的操作分类单位(operational taxonomic units,OTU)。通过将OTU的序列与核糖体数据库计划(ribosomal database project,RDP)数据库16S rRNA(trainset 16/release 11.5)进行比对,得到OTU的分类学位置。对所有样本的GM组成进行多元方差分析,以评估物理指标的影响。应用R语言中的vegan包进行排列组合和欧氏距离检测。

1.2.3 功能预测和富集

通过16S rRNA OTU分析,用PICRUST软件在默认设置下获得GM的功能分布。对于每个样本,通过京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的直系同源系统(the KEGG Orthology System,KO)计算微生物丰度,并检测KEGG数据库中Ⅰ级和Ⅱ级的富集功能类别。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组儿童的一般情况

本研究采集了27名CPE患儿和21名健康儿童的粪便样本。在实验组27名CPE患儿中,痉挛型CP有21例(77.78%),不随意运动型CP有5例(18.52%),共济失调型CP有1例(3.70%)。实验组与对照组儿童的心率、收缩压、舒张压、体质量指数(body mass index,BMI)比较差异均存在统计学意义(P<0.05),见表1。通常临床认为上述差异源于CPE患儿运动能力不足导致的体质较弱,与GM关系不大,因此仍然具有比较意义。

表1 两组儿童一般资料的比较

2.2 样本特征和数据输出情况

通过16S rRNA测序的读数连接成2 187 113个Tag;实验组有135～1 057个OTU,平均为(543.37±265.49)个;对照组有105～243个OTU,平均为(159.86±41.62)个,实验组的OTU数量明显高于对照组(t=6.542,P<0.001)。

经过RDP数据库比对,所有样本中GM共有20个门中307个属;实验组有48～248个属,平均为(156.56±48.50)个属;对照组有38～78个属,平均为(54.38±9.09)个属,实验组的GM属数量明显高于对照组(t=9.502,P<0.001)。

2.3 实验组与对照组儿童GM的相关性

2.3.1 实验组与对照组儿童GM多样性的分析

通过PCA分析结果的坐标数值和原始变量显示,两组儿童的GM主要以拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、普拉梭菌属(Faecalibacterium)、副杆菌属(Parabacteroides)为主;其中,实验组以Bacteroides、Bifidobacterium、Parabacteroides为主,对照组以Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium为主,见图1A;通过计算香农指数(Shannon index)判断GM的多样性,实验组的香农指数(1.87±0.23)明显高于对照组(1.29±0.31),两组比较差异有统计学意义(t=7.450,P<0.001),表明实验组微生物多样性更高,见图1B。

注:A图为实验组与对照组粪便样本GM的PCA分析结果(PC1=34.27%,PC2=16.33%);B图为实验组与对照组GM多样性分析结果。

2.3.2 实验组与对照组儿童GM差异的分析

从实验组和对照组GM中各选取了前15个最丰富的属,其中23个属在两组之间有不同程度的富集,见图2A。实验组与对照组相比,含有较多Bifidobacterium、链球菌属(Streptococcus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、肠球菌属(Enterococcus)、Prevotella、韦荣氏球菌属(Veillonella)、罗氏菌属(Rothia)、梭菌属Ⅳ(ClostridiumⅣ),而Bacteroides、Faecalibacterium、布劳特氏菌属(Blautia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、副萨特氏菌属(Parasutterella)明显较少。

注:A图为实验组与对照组儿童GM差异富集情况;B图为实验组与对照组儿童GM共现网络。

根据实验组与对照组GM间不同的富集菌属,构建了GM共现网络,见图2B。通过Spearman相关性评估显示,Bacteroides与乳杆菌属(Lactobacillus)和Prevotella均呈负相关(r=-0.627,P<0.05;r=-0.711,P<0.05),肠杆菌属(Intestinibacter)与Bifidobacterium和Enterococcus均呈负相关(r=-0.705,P<0.05;r=-0.713,P<0.05),而Streptococcus与放线菌属(Actinomyces)(r=0.793,P<0.05)、Actinomyces与Veillonella(r=0.818,P<0.05)、Veillonella与葡萄球菌属(Staphylococcus)(r=0.741,P<0.05)、Staphylococcus与链型杆菌属(Catenibacterium)(r=0.697,P<0.05)均呈正相关。

2.4 GM功能的改变与菌群生态失调的关系

实验组儿童神经退行性疾病风险的增加可能归因于Streptococcus、Parabacteroides和Bacteroides。在对照组GM中,Faecalibacterium、Blautia与“神经系统”相应作用,但其在实验组中却减少,在实验组GM中Streptococcus明显富集。此外,实验组中丰富的Akkermansia和Streptococcus可能是导致免疫系统疾病风险增加的主要原因,因为除了调节免疫系统外,Akkermansia和Streptococcus重点还参与了其宿主的大部分营养代谢。

通过PICRUST软件和KEGG数据库进行对照分析,结果显示,从所有样本中获得了5 887个KOs,所有的途径在KEGGⅡ级折叠成35个功能类别,其中22个在实验组与对照组之间有不同程度的富集,见图3。实验组富集的功能类别包括信号转导(signal transduction)通路和外源性物质降解与代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism)通路;与对照组相比,其他次生代谢产物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)通路和神经系统(nervous system)通路在实验组中有所减少。

注:上半部分热图为实验组与对照组儿童GM中前10个属对35个KEGGⅡ级功能类别的贡献,较深的绿色方块表示该属对功能类别的贡献很重要,而较深的粉色方块表示该属对功能类别的贡献较小;下半部分箱线图为实验组与对照组之间的富集途径,KEGGⅠ级功能类别中紫色表示细胞过程(cellular processes),绿色表示环境信息处理(environmental information processing),橙色表示遗传信息处理(genetic information processing),粉色表示人类疾病(human diseases),蓝绿色表示新陈代谢(metabolism),黄绿色表示生物体系统(organismal systems),黑色表示药物开发(drug development)。

3 讨论

CPE患儿的CP和癫痫两种疾病相互影响且关系密切,超过25%的CP患儿具有癫痫症状[23],而癫痫会加重CP患儿的运动和神经损伤[24]。关于肠道-大脑轴的诸多研究表明,GM对各种神经系统疾病存在显著的影响[25]。本研究重点探索了CPE患儿的GM特征及其在CPE发病机制中可能存在的潜在作用。

3.1 CPE患儿与健康儿童在GM结构方面的差异分析

本研究显示,与对照组的健康儿童相比,CPE患儿表现出较低比例的Faecalibacterium和Bacteroides。Joseph等[26]研究显示,Faecalibacterium可以用乙酸盐生产丁酸盐,而丁酸盐可以刺激调节性T(Treg)细胞的分化,缓解神经炎症的负担。然而,大量的乙酸盐会在丁酸弧菌属(Butyricimonas)和Faecalibacterium丰度低的CPE患儿中积累,这可能会激活副交感神经系统并引发癫痫发作。此外,Faecalibacterium的减少也会减少丁酸盐的分泌,减弱其对CPE患儿的神经保护作用。本研究在实验组患儿体内发现了较多的Enterococcus、Bifidobacterium、ClostridiumⅣ和Akkermansia的含量。Enterococcus可以刺激绒毛膜细胞产生5-羟色胺,通过神经调节改善自闭症行为。尽管Bifidobacterium因其执行上皮屏障的能力而被认为是一种有益的微生物,但其较高的丰度也表明患儿的微生物群尚未成熟。此外,ClostridiumⅣ的丰度较高,其作为一种潜在的致病菌,会加重CPE患儿的肠道微环境失调,出现腹痛腹泻的情况[27]。本研究显示,随着非主导菌属的增加,CPE患儿的GM表现出比健康儿童更高的微生物多样性。由于GM内部存在复杂的竞争和协同关系,本研究进一步构建了菌属共现网络,以加深对CPE患儿GM特征的进一步了解。

3.2 CPE患儿GM功能的改变与其失调的相关分析

本研究中共现网络显示,实验组与对照组多种菌属之间存在负相关关系。这些拮抗关系表明,具有稳定GM的健康个体体内,Bacteroides的优势将抑制Bifidobacterium和Lactobacillu的过度生长。可能由于其高度的多样性和丰度,Bacteroides参与了多种代谢途径,包括氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢,其丰度也反映出Bacteroides可以适应成人的多样化饮食,并为宿主及其他肠道共生动物提供能量和底物。

本研究对GM功能的进一步分析显示,实验组患儿的免疫系统疾病和神经退行性疾病的风险增加,神经炎症可能在实验组的病理中起关键作用。免疫系统疾病风险的升高主要归因于实验组患儿Akkermansia比例较高。据以往研究显示,Akkermansia的过度生长会降解黏膜层中的黏蛋白,增加黏膜的通透性,这使得更多的细菌抗原暴露在宿主的免疫系统中,引发CPE患儿的系统免疫反应[28]。此外,Streptococcus的增长会提高白介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平,并通过诱导神经炎症诱发神经退行性疾病。结合菌属之间的共存关系,推测成熟稳定的GM对患儿神经系统的发育至关重要。因此,CPE患儿的临床症状可能会通过GM的干预得到缓解。本研究中通过PICRUST软件和KEGG数据库的对照分析显示,从所有样本中获得了5 887个KOs;所有的途径在KEGGⅡ级折叠成35个功能类别,其中22个在实验组与对照组之间有不同程度的富集。实验组富集功能类别的表现与免疫系统疾病通路和神经退行性疾病通路的风险增加相一致。

有研究表明,GM与各种神经系统疾病,如孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders,ASD)、帕金森病、阿尔茨海默病等的发病及进展存在密切关系[29]。GM通过分泌次级代谢物进入血液循环,可以刺激中枢神经系统,进而影响宿主的压力、认知和情绪[30]。Vacca等[31]和De Angelis等[32]研究显示,ASD患儿中梭状芽孢杆菌属(Clostridiumsp.)可能会压制肠铬素细胞的激活和5-羟色胺的分泌;此外,在神经退行性疾病患儿的GM中发现Prevotella减少、Lactobacillus增加,这与神经炎症有关。另有研究显示,在癫痫患儿中发现了变形杆菌(Proteobacteria)和克罗诺杆菌(Cronobacter)的增加,证实了GM在控制癫痫发作中的作用[33]。

目前本研究的一个局限是入组例数有限,如果提高入组患儿的数量并进一步开展癫痫患儿与健康儿童GM的比较,可深入探讨GM在CPE发病机制中的作用,这将提高对肠道-大脑轴的理解。在后续的研究中,将重点进行大队列研究以验证目前的发现,并且探索实验组患儿肠道代谢物的改变情况及其与微生物群的关系,以及CPE患儿治疗后的临床改善状况。

综上所述,本研究介绍了CPE患儿的GM特征,说明了GM内菌属的关系,并检测了CPE患儿GM的功能分布。这些研究结果提示了GM在CPE发病机制中的作用,并为CPE治疗中的菌属靶标辅助干预提供了数据参考和理论支持。