利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

韩佃刚，胡娟，董俊，周思佳，陈朝林，张家翔，信吉阁*

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的基因敲除细胞

韩佃刚1,2，胡娟3，董俊2，周思佳3，陈朝林3，张家翔3，信吉阁3*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.昆明海关技术中心，云南 昆明 650200；3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因敲除细胞：根据NCBI数据库猪基因(Gene ID为396801)序列设计sgRNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在基因第一外显子上设计1条sgRNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。

猪；低密度脂蛋白受体基因；基因敲除；CRISPR/Cas9系统

动脉粥样硬化是引起急性心肌梗死、卒中等重大疾病的首要病因[1]。这些疾病的发病过程中，低密度脂蛋白受体(LDLR)和载脂蛋白E(ApoE)起着关键性的作用。LDLR是一种细胞表面糖蛋白，广泛存在于体内组织或细胞中，如肝脏、肾上腺、成纤维细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞等[2]。LDLR可以与ApoE结合，进而清除血中的脂蛋白颗粒；另外，LDLR可通过与低密度脂蛋白(LDL)颗粒上的脂蛋白B(ApoB)相互作用，清除血中的LDL[3]。由此可见，LDLR在清除血液中的胆固醇和甘油三酯富集的脂蛋白颗粒中扮演着非常重要的角色。啮齿类动物是目前应用最广泛的动物模型，–/–基因敲除的小鼠、大鼠被广泛作为动脉粥样硬化的模型动物，而其与人亲缘关系较远，遗传背景、体型以及寿命等方面与人类有较大差异，转化医学和临床前研究需要非啮齿类动物模型。猪在解剖结构、生理代谢及疾病发生机理等方面与人有很多相似之处，被认为是理想的动物模型[4]。构建猪动物模型在心血管相关研究及转化医学领域优势明显。CRISPR/Cas9基因编辑系统作为基因编辑系统的第3代工具，具有操作简单、敲除效率高、实验成本低等优势，为大动物基因编辑提供了一个有效的技术支持[4–7]。本研究中，利用CRISPR/Cas9系统构建猪基因打靶载体，通过转染、筛选等多个技术环节构建猪基因敲除细胞模型，以期为细胞水平研究基因功能和构建基因敲除动物提供依据。

1　材料和方法

1.1　主要试剂

Cas9质粒(41815)、sgRNA质粒(41819)购自Addgene；引物购自昆明硕擎生物科技有限公司；限制性内切酶、连接酶等购自Fermentas；猪胎儿成纤维细胞由云南农业大学动物医学院实验室冻存；DMEM/F12、PBS、胎牛血清均购自Thermo；PCR仪购自ABI；双稳定电泳仪购自北京六一仪器厂；细胞电转仪购自Bio–Rad；凝胶成像系统购自Genentech；培养箱购自Thermo；超净工作台购自广州瑞智净化设备有限公司。

1.2　方法

1.2.1基因序列设计

根据CRISPR/Cas9系统GN20GG设计法则，依照GenBank中序列信息(Gene ID为396801)，在靠近起始密码子ATG位置选择打靶序列，设计一条sgRNA序列。合成靶序列，在正义链5¢端添加CACC接头(Oligo1)，在反义链的5¢端添加AAAC接头(Oligo2)，便于酶切载体连接。

1.2.2sgRNA载体构建

2条sgRNA进行退火反应。反应体系包括Oligo1 10 μL、Oligo2 10 μL、NEB Buffer3 5 μL、ddH2O 25 μL。将配制好的体系混匀、瞬离，置于沸水中加热5 min，自然冷却至室温(3～4 h)。用Solution I将退火产物与经I酶切sgRNA质粒连接，反应体系为线性化sgRNA质粒0.5 μL、Solution I 5.0 μL、退火产物4.5 μL；16 ℃连接30 min，并将连接产物转化入大肠杆菌Top10中，涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，37 ℃过夜培养，挑取单克隆、摇菌，并送昆明硕擎生物科技有限公司测序，鉴定靶序列正确插入。

1.2.3细胞转染与单克隆筛选

参照文献[8]的方法，先进行猪胎儿成纤维细胞复苏培养，汇合度达80%时进行细胞转染。取生长状态良好的细胞1×107个，用PBS清洗2次，重悬在600mL PBS中，将其转入电转杯中，加入质粒Cas9、sgRNA各50mg并吹打混匀，将电转杯放入电转仪中进行转染，转染参数为230 V、500mF。电转染后将细胞分到15个直径为10 cm的培养皿中培养；隔天换液，换成含G418(质量浓度为800 μg/mL)的培养基培养；隔2 d换液，筛选8～10 d后用细胞克隆环挑取单克隆细胞，转移到48孔板培养，待48孔板中细胞长满传代到24孔板。

1.2.4基因敲除细胞克隆鉴定

NP40裂解细胞先56 ℃裂解1.5 h，再95 ℃裂解10 min。扩增靶序列片段，引物为–F (5¢–ATGAAGTCCACGGGCTGGGT–3¢)和–R (5¢–GTCCTGGCAGCGGAACTCA–3¢)。PCR条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环。取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，PCR产物以正向引物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。测序结果运用Vector NTI 11.5与原序列比对，采用pMD19–T Vector Cloning Kit经TA克隆、连接、转化、提质粒后用通用引物M13测序。测序结果与原序列比对，鉴定基因敲除情况。

2　结果与分析

2.1　LDLR基因序列设计结果

设计的sgRNA序列为GCTGCAGTGGAAG AGAAATG，PAM为TGG，并合成靶序列Oligo1 (5¢–CACCgctgcagtggaagagaaatg–3¢)和Oligo2(5¢–AA ACcatttctcttccactgcagc–3¢)。

2.2　sgRNA载体构建结果

将2条sgRNA Oligo退火，形成双链后连接到I酶切的sgRNA质粒上，转化入大肠埃希菌，并挑取单克隆菌落测序，结果如图1所示，显示序列连接正确。

图1　sgRNA载体测序结果

2.3　细胞转染与单克隆筛选结果

把Cas9质粒、sgRNA质粒转染到猪胎儿成纤维细胞，观察到细胞长势良好，呈典型的成纤维细胞形态，培养8～10 d，形成单克隆细胞(图2)。

图2　培养3 d(a)和8 d(b)的猪胎儿成纤维细胞克隆

2.4　基因敲除细胞克隆鉴定结果

经筛选、培养后共获得30个单细胞克隆，琼脂糖凝胶电泳检测部分结果如图3所示，在预期片段大小处有单一明亮条带。测序结果显示，23个细胞测序成功，序列比对结果显示为7个细胞克隆在靶位点发生了突变，敲除效率为30.4%。确定的靶位点序列变化列于表1。序列变化有碱基缺失、插入。

图3　基因敲除猪胎儿成纤维细胞克隆的PCR鉴定电泳结果

表1　基因敲除猪胎儿成纤维细胞克隆基因测序结果

WT示野生型的靶位点序列。红色碱基为sgRNA靶位点序列；蓝色碱基为PAM结合位点序列。“△”示碱基缺失；“+”示碱基插入。

3　结论与讨论

在CRISPR/Cas9系统中，sgRNA引导Cas9核酸酶在基因的靶位点形成双链或是单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制，包括非同源重组的末端链接修复和精确的同源重组机制，而非同源重组的末端链接修复中会发生随机的碱基插入或缺失[9–10]。本研究中，在基因第一外显子上设计1条sgRNA，构建敲除打靶载体，细胞转染、筛选获得细胞克隆，鉴定了7个细胞克隆在基因靶位点发生碱基插入或缺失，表明sgRNA编辑了基因。利用CRISPR/ Cas9系统在多个物种上进行基因敲除研究多有报道，如绵羊肌肉卫星细胞基因的靶向敲除[11]，构建基因敲除的小鼠[12]，敲除HEK293FT细胞系的基因[13]，敲除猪胎儿成纤维细胞系的基因[14]等，本研究结果与这些研究的类似。

本研究中，敲除效率为30.4%，这与赵为民等[15]的CRISPR/Cas9系统介导大鼠L6细胞基因编辑研究中的敲除效率类似。朱晓晗等[16]的CRISPR/Cas9技术构建巴马小型猪基因敲除细胞系的效率是45.5%；徐长江等[17]的利用CRISPR/ Cas9系统构建基因敲除的猪回肠上皮细胞系的效率为15.5%；赵丽华等[18]基于CRISPR/ Cas9系统制备猪基因敲除细胞系效率为45.21%。可见，敲除效率有待进一步提高。

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Generation of-knockout pig cells using by CRISPR/Cas9 technology

HAN Diangang1,2，HU Juan3，DONG Jun2，ZHOU Sijia3，CHEN Chaolin3，ZHANG Jiaxiang3，XIN Jige3*

(1.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China; 2.Technology Center of Kunming Customs, Kunming, Yunnan 650200, China; 3.College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China)

The objective of this study was to disrupt the low density lipoprotein receptor gene() of pig cells using the CRISPR/Cas9 system. Specific guide RNA(sgRNA) sequences were designed based on thesequence from the NCBI database(Gene ID 396801). A CRISPR/Cas9 target vector was constructed and porcine embryonic fibroblasts colonies were generated through electrotransfection and G418 screening. Genotype identification was performed on the cell colonies. PCR products were cloned into a T vector and subjected to sequence alignment. The efficiency of gene knockout was analyzed statistically. The sgRNA was designed to target the first exon of thefollowing the GN20GG rule. DNA sequence assays confirmed the correct construction of the target vector, which was subsequently introduced into porcine fetal fibroblasts using electroporation. In total, 30 monoclonal cells were isolated, with successful sequencing of 23 colonies. Among these, seven cell colonies exhibited gene modifications, resulting in a fragment knockout efficiency of 30.4%.

pig;gene; gene knockout; CRISPR/Cas9 system

S828.9；Q78

A

1007–1032(2023)04–0468–04

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.014

2022–06–07

2023–08–11

国家自然科学基金项目(31960658、31360532)；云南省科技计划项目(2013FB041)

韩佃刚(1980—)，男，山东潍坊人，博士，高级兽医师，主要从事检验检疫研究，1227394912@qq.com；*通信作者，信吉阁，博士，教授，主要从事兽医公共卫生学研究，1104263681@qq.com

韩佃刚，胡娟，董俊，周思佳，陈朝林，张家翔，信吉阁．利用CRISPR/Cas9技术构建猪基因敲除细胞[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(4)：468–471．

HAN D G，HU J，DONG J，ZHOU S J，CHEN C L，ZHANG J X，XIN J G．Generation of-knockout pig cells using by CRISPR/Cas9 technology[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：468–471．

http://xb.hunau.edu.cn

责任编辑：邹慧玲

英文编辑：柳正