补肾活血方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响※

孔繁达,张罗丹,张 艳

(1.山西省中医院,山西 太原 030012;2.辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032)

心室重构导致心功能下降是心力衰竭发生发展的重要机制[1]。心肌梗死导致心室结构改变,梗死区的心肌细胞坏死、凋亡,并发生纤维化,形成瘢痕组织[2];非梗死区未受损伤的心肌在代偿过程中也会出现反应性纤维化,导致心肌重量及结构发生改变,最终引起心功能逐渐下降,发展为心力衰竭[3]。Klotho是一种抗衰老相关基因,位于13q12 染色体上,编码形成Klotho蛋白[4]。Klotho蛋白通过参与多种机制改善心室重构,提高心功能,减缓心力衰竭进展[5-6]。研究显示,Klotho蛋白可抑制Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路传导,减轻心肌纤维化[7-8]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信号通路关键效应分子。心力衰竭归属中医“水肿”“喘证”等范畴,其病位在心,与肺、脾、肾相关。辽宁省名中医张艳教授提出“心肾相关”理论,创立补肾活血方,该方在参草通脉颗粒基础上化裁而成,可有效缓解慢性心心力衰竭患者的临床症状,延缓心力衰竭进展[9-10]。本研究采用补肾活血方干预心力衰竭大鼠,观察其心肌纤维化程度、心脏超声值及血清N 基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)、心肾组织Klotho蛋白、心肌组织β-catenin 蛋白表达水平的变化,探讨补肾活血方改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纤维化的生物学机制。

1 实验材料

1.1 药物 补肾活血方组成:菟丝子20 g,龟甲胶15 g(烊化),黄精20 g,黄芪40 g,丹参30g,人参片10 g,红花15 g,干益母草20 g,三七粉5 g,中药饮片由山西省中医院药剂中心提供。培哚普利片[施维雅(天津)制药有限公司,国药准字H20034053,4 mg/片]。

1.2 动物 选取12周龄清洁级雄性健康Wister大鼠80只,体质量(250±20)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,批号[SCXK(京)2016-0002],采用普通大鼠饲料喂养。

1.3 动物饲养环境 室温为(23±2)℃,湿度为50%~60%,遮光板调节光线为明暗交替(明12 h,暗12 h),大鼠饲料正常喂养,自由饮水,每周更换垫料3次。

1.4 主要试剂及仪器 注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂,国药准字H23021441),β-catenin 一抗(美国Cell signaling technology 公司,9562),Klotho 一抗(北京博奥森公司,bs-2925R),3-磷酸甘油酸脱氢酶(GSK3β)一抗(英国abcam 公司,ab280376),羊抗兔二抗(HRP 标记)(英国abcam 公司,ab15007776),ELISA 试剂(英国abcam 公司,ab108806),Masson染色液为自制。1 HX-300S 动物呼吸机(成都泰盟有限公司),小动物心电图机(湖南鼠行生物科技有限公司),Vivid 7 Dimension彩色多普勒超声检测仪(美国通用电气公司),聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(北京索莱宝科技有限公司),微量可调移液器(德国Eppendorf公司),水平摇床(北京六一仪器厂),烘干箱(南京万能加热设备厂)。

2 方法

2.1 造模 在80只Wister大鼠中随机选取60只造模。大鼠喂养1周后,通过腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉。将大鼠心前区部位脱毛备皮,背位固定后连接心电图仪器,记录术前大鼠心电图。经喉进行气管插管,气道开通后连接小动物呼吸机。应用碘伏在大鼠第3、4肋间消毒并开胸,用镊子钝性分离胸部肌肉,用自制拉钩拉开肋间隙,用小镊子撕开心包。助手挤压大鼠对侧胸腔,上抬左侧后背部,使心脏暴露并上移至胸腔开口处。寻找左心耳,手术灯下分辨左冠状动脉,在左冠状动脉开口往下约2 mm 处,用4-0号带针缝合线进行结扎[11]。冠状动脉结扎后可见心电图监测中ST 段明显抬高。挤出大鼠胸腔中的空气,迅速缝合胸壁,待大鼠呼吸平稳后,撤去呼吸机。假手术组大鼠冠状动脉挂线但不结扎,其余步骤与造模大鼠相同。术后对大鼠进行青霉素钠(每日5万单位)腹腔注射及常规喂养,持续1周。第2周开始饲料减半,同时进行每日1次的力竭式游泳。灌胃4周后对大鼠进行心脏超声心动图检查左心室射血分数(LVEF)≤40%则表示造模成功[12]。

2.2 分组与药物治疗 造模成功的存活大鼠共48只,应用随机数表法分为模型组、补肾活血组、培哚普利组,每组16只。假手术组存活20只,为平衡组数,随机选出16只作为最终的假手术组。补肾活血组采用补肾活血汤[前期实验发现,中剂量浓度治疗效果最佳,故此次实验以中剂量浓度[17.5 g/(kg·d)]进行配比]灌胃,培哚普利组采用由培哚普利片配制的混悬液[1.0 mg/(kg·d)]灌胃,模型组及假手术组参照补肾活血组每日采用等量蒸馏水灌胃。各组大鼠均灌胃4周。

2.3 动物取材 大鼠禁食不禁水12 h后,腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。将麻醉后的大鼠固定于鼠板,打开大鼠胸腔腹腔,经腹主动脉采血10 m L,离心(转速2 000 r/min,离心半径10 cm)2 min备用。剪取大鼠心脏及肾脏,于0.9%氯化钠溶液中清洗3次,洗去残余血液或血块。剪去大鼠心脏中心房组织,保留心室组织。将部分心室组织及肾脏组织放入液氮中保存,准备蛋白质免疫印迹实验。将部分心室组织浸泡于4%多聚甲醛溶液,准备染色用。

2.4 指标检测

(1)超声检测 各组大鼠灌胃4周后,采用Vivid 7 Dimension彩色多普勒超声检测仪行心脏超声检测。连续测量3 个心动周期中的左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD),计算LVEF及左心室短轴缩短率(FS),并取平均值。

(2)血清NT-proBNP 检测 采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清NT-proBNP浓度。设置标准品孔、样本孔和空白孔,标准品孔配制不同浓度标准品,样本孔添加待测样本,空白孔不加。标准品孔和样本孔中加入HRP标记的检测抗体,于37 ℃水浴锅温育60 min。经弃液、拍干、洗涤、拍干流程5次。各孔加入底物A、B各50μL,在37 ℃下避光孵育15 min,后加入终止液终止反应。以空白孔调零,于450 nm 波长处测定各孔吸光度(OD)值。根据标准品浓度及相应OD 值计算出直线回归方程,再用样本OD 值计算出样本浓度。

(3)Masson 染色及心肌胶原纤维容积分数(CVF)测定 心肌组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡等过程处理。病理切片准备好后,按照以下流程染色:核染液染色60 s,甩掉染液,用冲洗液冲洗30 s→浆染液染色30 s,甩掉染液,用冲洗液冲洗30 s→分色液分色6~8 min,甩掉分色液→蓝色复染液染色5 min,甩掉复染液,无水乙醇冲洗干净→吹干切片,中心树胶封片,显微镜下观察并拍照。显微镜下观察蓝染胶原纤维的分布情况,拍摄并测量不相连的视野,计算CVF。

(4)心脏组织Klotho蛋白、β-catenin蛋白及肾脏组织Klotho蛋白测定 取材后将心脏及肾脏组织进行研磨、离心、蛋白变性处理,采用BCA 法测定样品的蛋白浓度。将样品加至电泳仪中进行电泳,使不同分子大小的蛋白逐渐分离,进而转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。分别加入Klotho、β-catenin一抗,再加入羊抗兔二抗(HRP 标记)、显色液,放入成像仪中显影,可见灰色条带。用Image J分析条带灰度并计算相对值。

2.5 统计学方法 应用SPSS 25.0统计软件分析数据。计量资料符合正态分布时以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般情况观察 造模结束后,除假手术组外,其他组大鼠毛色晦暗甚至脱毛,精神萎靡,活动性差,饮食减少,部分大鼠肢体水肿,伴有咳嗽、喘促症状。经药物治疗后,培哚普利组、补肾活血组大鼠毛色逐渐恢复光泽,精神转佳,活动度、饮食均有增加,无咳喘症状。

3.2 心脏超声指标比较 灌胃4 周后,与假手术组比较,模型组LVEDD、LVESD 均增大,LVEF、FS均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,培哚普利组、补肾活血组LVEDD、LVESD 均减小,LVEF、FS 均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。培哚普利组与补肾活血组LVEDD、LVESD、LVEF、FS比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心脏超声指标比较(±s)

表1 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心脏超声指标比较(±s)

注:1.LVEDD,左心室舒张末期内径;LVESD,左心室收缩末期内径;LVEF,左心室射血分数;FS,左心室短轴缩短率。2.与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05。

组别只数 LVEDD(mm)LVESD(mm) LVEF(%)FS(%)假手术组16 5.24±0.53 3.41±0.43 67.31±4.17 47.19±5.48模型组16 7.71±0.85△ 5.49±0.76△38.35±6.47△25.71±3.01△培哚普利组16 6.30±0.66▲ 4.15±0.44▲57.24±5.67▲36.87±4.83▲补肾活血组16 6.19±0.58▲ 3.75±0.47▲58.53±4.23▲36.43±5.16▲

3.3 血清NT-proBNP水平比较 灌胃4周后,与假手术组比较,模型组血清NT-proBNP水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,培哚普利组、补肾活血组血清NT-proBNP水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。培哚普利组与补肾活血组血清NT-proBNP 水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后血清N 基末端脑利钠肽前体水平比较(pg/m L,±s)

表2 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后血清N 基末端脑利钠肽前体水平比较(pg/m L,±s)

注:与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05。

组别只数N 基末端脑利钠肽前体假手术组16 453.23±10.58模型组16 3 426.76±86.73△培哚普利组16 1 079.42±35.62▲补肾活血组16 1 145.28±38.51▲

3.4 Masson染色及CVF 比较 假手术组大鼠心肌组织纤维束排列紧密有序,未见明显胶原纤维增生,胶原纤维主要分布于血管周围;模型组大鼠心肌胶原纤维增生明显,部分心肌被胶原组织取代,局部可见大面积胶原增生,并蔓延至心肌纤维束间,呈网状分布,心肌细胞排列紊乱;补肾活血组及培哚普利组大鼠心肌细胞排列比较整齐,以点灶状的胶原纤维为主(扫描题目右侧二维码查看图1)。灌胃4周后,与假手术组比较,模型组CVF升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,培哚普利组、补肾活血组CVF降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。培哚普利组与补肾活血组CVF 比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌胶原纤维容积分数比较(%,±s)

表3 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌胶原纤维容积分数比较(%,±s)

注:与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05。

组别只数心肌胶原纤维容积分数假手术组16 5.43±0.58模型组16 15.16±0.73△培哚普利组16 9.09±0.61▲补肾活血组16 9.75±0.52▲

3.5 心肌组织Klotho蛋白、β-catenin蛋白表达比较灌胃4 周后,与假手术组比较,模型组心肌组织β-catenin蛋白表达升高,心肌组织Klotho蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,培哚普利组、补肾活血组心肌组织β-catenin蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);补肾活血组心肌组织Klotho蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与培哚普利组比较,补肾活血组心肌组织β-catenin蛋白表达降低,心肌组织Klotho蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌组织β-catenin、Klotho蛋白免疫印迹图见图2。

图2 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌组织β-catenin、Klotho蛋白免疫印迹图

表4 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌组织β-catenin、Klotho蛋白表达比较(±s)

表4 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后心肌组织β-catenin、Klotho蛋白表达比较(±s)

注:与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05;与培哚普利组比较,*P<0.05。

组别只数β-catenin蛋白(相对值) Klotho蛋白(相对值)假手术组16 1.00±0.01 1.00±0.01模型组16 1.68±0.27△0.53±0.06△培哚普利组16 1.31±0.09▲0.56±0.08补肾活血组16 1.09±0.06▲*0.78±0.09▲*

3.6 肾脏组织Klotho蛋白表达比较 灌胃4周后,与假手术组比较,模型组肾脏组织Klotho蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,培哚普利组、补肾活血组肾脏组织Klotho蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。培哚普利组与补肾活血组肾脏组织Klotho蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后肾脏组织Klotho蛋白免疫印迹图见图3。

图3 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后肾脏组织Klotho蛋白免疫印迹

表5 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后肾脏组织Klotho蛋白表达比较(±s)

表5 4组心肌梗死后心力衰竭大鼠灌胃4周后肾脏组织Klotho蛋白表达比较(±s)

注:与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,▲P<0.05。

组别只数Klotho蛋白(相对值)假手术组16 1.00±0.01模型组16 0.51±0.03△培哚普利组16 0.82±0.06▲补肾活血组16 0.87±0.08▲

4 讨论

心肌梗死是导致心力衰竭的重要病因[13]。心肌梗死后心肌纤维化促进心室重构进而导致心功能下降是心力衰竭发生发展的重要机制。心肌梗死后梗死区和非梗死区均可发生心肌纤维化。梗死区心肌纤维化最终形成瘢痕组织,防止梗死后心室破裂,维持心室的完整性[2]。梗死区成纤维细胞可通过炎症刺激转变为肌成纤维细胞,并大量分泌细胞外基质,改变心肌间质胶原成分,重塑心室。梗死区室壁结构异常造成机械应力失衡,非梗死区心肌转化生长因子-β1(TGF-β1)被激活,使心肌纤维化。此外,梗死区肌成纤维细胞可持续分泌促纤维化因子,促进非梗死区间质纤维化及胶原沉积,导致心室顺应性下降,影响心功能[14]。本研究证实,心肌梗死后心力衰竭可出现明显的心肌纤维化,与文献中报道相符[15]。补肾活血方和培哚普利均能降低心肌纤维化程度,抑制心肌梗死后心肌纤维化进展。培哚普利属于ACEI类药物,研究表明,血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类药物可通过拮抗促血管生成素2(AngⅡ)对心肌的纤维化作用,进而延缓心室重构进展[16-18]。图1(扫描题目右侧二维码查看)中,补肾活血组大鼠心肌纤维化(蓝色区域)与培哚普利组大鼠相近。

研究显示,Wnt信号通路的激活参与心肌纤维化进程[19-20]。Wnt信号通路包括经典通路和非经典通路,经典通路指Wnt/β-catenin信号通路,非经典通路包括Wnt/平面细胞极性(PCP)途径和Wnt/Ca2+途径[21]。Wnt/β-catenin信号通路主要由Wnt配体、跨膜受体、胞浆调节蛋白、核内转录因子等部分组成,涉及多类蛋白家族。Wnt信号通路激活时,Axin、CK1、GSK3β、APC和β-Tr CP 组成的复合物被招募到细胞膜上,解除对β-catenin的降解,胞质内β-catenin含量逐渐积累并进入细胞核中,激活下游WISP-1[8],促进心肌成纤维细胞增殖。研究发现,心肌梗死后心肌梗死区与非梗死区的心肌纤维化进程均受到Wnt/β-catenin信号通路的影响[22]。因此,在心肌梗死后心力衰竭的研究中,Wnt/β-catenin信号通路至关重要。Wnt/β-catenin信号通路的激活与表达受Klotho蛋白调控。Klotho蛋白由Klotho基因编码而成,分为膜型和分泌型,其中膜型Klotho蛋白主要由肾脏表达。Klotho蛋白胞外段可与Wnt通路中配体结合,阻断Wnt受体与配体结合,抑制通路信号激活。此外,Klotho蛋白可直接抑制Wnt/β-catenin信号通路与关键效应蛋白β-catenin的入核过程[7]。

“心肾相关”是指心、肾在生理、病理上相互联系和影响。《黄帝内经》将阴阳五行元素融入医学理论,认为心脏为阳中之阳,属火,具有火的特性;肾脏为阴中之阴,属水,具有水的特性。后世医家根据水火、阴阳交互规律延伸出“心肾水火相济”理论。此外,心、肾二脏可通过经络相互联系。《灵枢·经脉》云:“肾足少阴之脉……其支者,从肺出络心,注胸中。”《灵枢·营气》描述营气的循行路线:“循足心,注足少阴,上行注肾,从肾注心,外散于胸中。”《灵枢·卫气行》描述卫气的循行路线:“其始入于阴,常从足少阴注于肾,肾注于心。”经过历代医家的发挥,“心肾相关”理论逐渐完善。张景岳提出君火、相火论,认为君火在上,为一身主宰;相火在下,为神明基础。相火秘藏,则心阳充足;心阳充足,则相火旺盛。肾精肾气充足,则心气、心阳化生有源,鼓动气血运行。在西医学中,Klotho蛋白主要由肾脏分泌产生,可阻碍心肌细胞凋亡,延缓心室重塑作用。因此,通过提高Klotho蛋白含量,可有效阻碍心衰病情进展。

现代医家认为,心肌成纤维细胞分泌的细胞外基质及心肌胶原纤维增加,在某种程度上类似于中医学中水湿、痰饮等病理产物内停[23]。心力衰竭的病因包括外邪侵袭、饮食不节、情志失调、劳逸失度、禀赋异常,主要病机为心之气血阴阳虚衰,脏腑功能失调,心失所养,心血不运,血脉瘀阻,痰浊内停。在慢性心力衰竭病机演变中,水湿、痰饮内停与心肾失调密切相关。肾精不足,气不得化,肾气亏虚,进一步导致气虚不能运化水液,水液留滞脏腑,形成水湿、痰饮,而水湿、痰饮阻滞经脉,进一步加重心力衰竭。补肾活血方在“心肾相关”理论指导下并结合临床经验而成,具有补肾精、益心气的功效,体现心肾同治的思想。本研究结果显示,灌胃4 周后补肾活血组大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS均有改善,血清NT-proBNP 水平下降,说明补肾活血方可有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能。

本研究结果显示,与假手术组比较,模型组心肌及肾脏组织中Klotho蛋白表达降低,β-catenin蛋白表达增加,提示Wnt经典通路被激活。与培哚普利组比较,补肾活血组心肌组织β-catenin蛋白表达降低(P<0.05),心肌组织Klotho蛋白表达升高(P<0.05),提示补肾活血方可能通过上调Klotho 蛋白表达来抑制Wnt/β-catenin信号通路的表达,也可能直接抑制通路关键效应分子β-catenin的表达,进而抑制下游WISP-1的转录,延缓心肌纤维化及心力衰竭进展。此外,补肾活血方下调β-catenin蛋白表达作用更强,可能机制为补肾活血方通过上调Klotho蛋白抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,降低β-catenin蛋白表达,还可直接抑制β-catenin表达。后期实验预计在Klotho基因沉默条件下,进一步观察补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的干预,明确补肾活血方的具体作用靶点。