牦牛源短小芽胞杆菌TS1的分离鉴定及其生物学特性研究

刘银坤,李昊,李子昕,李知新,张玉彦,李文财,任建军,唐姝*

(1.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095;2.宁夏动物疾病预防控制中心,宁夏 银川 750199;3.宁夏安利森生物科技有限公司,宁夏 银川 750001)

抗菌药物是人类和畜禽防治细菌感染的重要手段。随着抗菌药物的不当使用或滥用,细菌对常用抗菌药物的耐药性日趋严重。因此,“饲料端禁抗、养殖端减抗、限抗”已成为全球共识。欧盟自2006年1月开始不允许抗菌药物作为饲料添加剂使用,中国自2020年开始也禁止在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用抗生素[1-2]。在“禁抗限抗”的大背景下,急需开发抗生素替代产品用于畜禽临床生产实践。目前益生菌是应用较广的替代产品之一,益生菌添加剂不仅可以提高动物生长速度,还可以维持肠道菌群平衡,并且可以通过调控畜禽肠道菌群维持肠道上皮的稳态,从而促进畜禽肠道健康[3-5]。益生菌本身及其代谢产物又具有广谱抗菌作用,因此筛选不同动物来源的益生菌是“减抗限抗”大背景下抗生素替代品开发的有效方式。

农业部2013年公布了饲料添加剂的品种目录,共有13种类别,其中包括短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)[6]。短小芽胞杆菌被广泛应用的优势：1)易保存、抗逆性好,分离、培养和保藏的条件简单,对工业化工生产技术要求低,能够在肠胃中保持稳定作用并且保持较高活性;其芽胞对外在的恶劣环境(如热、紫外线、电离辐射和低pH等)有较强抵抗作用[7];2)当摄入足够量时能够预防或改善腹泻[8],缓解不耐乳糖症状,预防生殖系统感染[9],增强畜禽免疫力[10],促进肠道消化系统健康[11-12],降低血清胆固醇,帮助吸收营养成分与促进畜禽生长[13-14]等。综上,短小芽胞杆菌具有易保存、活性成分高等优势,值得大量推广和应用。

本试验从健康牦牛粪便中分离到1株具有益生潜力的短小芽胞杆菌,对其形态学、生理生化、耐酸、耐胆盐、对常用抗菌药物的敏感性及对常见病原菌的抑菌活性等进行研究,旨在评价其用于制备益生菌添加剂的可行性,为动物来源的益生芽胞杆菌的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

于甘肃将军山丹军马场无菌采集健康牦牛粪便,一部分用于室温分离短小芽胞杆菌,剩余样品-80 ℃保存。

1.2 主要试剂

试验所需主要试剂为LB培养基(青岛海博生物技术有限公司)、LB液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)、Landy培养基(上海瑞楚生物科技有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS,南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、革兰氏染色液(南京建成生物工程研究所)、盐酸(优级纯,HCl含量36%～38%)、牛胆盐(上海源叶生物科技有限公司,胆酸含量大于等于60%)、细菌16S rRNA通用引物及PCR 2xTaqMaster Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、生化鉴定管(广州环凯微生物科技有限公司)、药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司和北京索莱宝科技有限公司)等。

1.3 菌株的分离与纯化

取1 g左右牛粪样品至装有5 mL无菌生理盐水的玻璃试管中,用封口膜封住管口于沸水中煮沸10 min;取煮沸后的100 μL上清液至装有5 mL LB液体培养基的EP管中,放入摇床,37 ℃、160～180 r·min-1振荡培养16～18 h;取100 μL菌液加入5 mL液体培养基中再次振荡培养16 h;蘸取菌液在LB固体培养基中划线,于37 ℃恒温箱中倒置培养12～18 h,挑取单菌落接种LB固体培养基于37 ℃恒温箱培养12～18 h,再次挑取单菌落至5 mL LB液体培养基中振荡培养16～18 h,得到纯化菌液。

1.4 细菌16S rRNA PCR扩增、测序以及同源性和系统进化树分析

将分离纯化后的菌液用16S rRNA引物按照说明书进行PCR扩增,产物在10 g·L-1的琼脂糖凝胶中进行电泳。将含有目的条带的PCR产物原液送至北京擎科生物科技有限公司进行一代测序;将纯化后的菌液送至上海凌恩生物科技有限公司进行基因组DNA提取以及全基因组测序。使用PacBio RS和Illumina测序平台对TS1基因组进行全基因组测序。使用ABySS(http：//www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)进行基因组组装,再使用canu(https：//github.com/marbl/canu)来组装PacBio校正后的长读数,最后用GapCloser(https：//sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/)填补剩余的局部内部空白,并纠正单碱基多态性,得到最终的组装结果。用Circos v0.64(http：//circos.ca/)绘制完整基因组圈图。将测序得到的一代测序即16S rRNA序列提交到NCBI中进行BLAST比对,将同源性高于99%的菌株以及其他芽胞杆菌属的代表菌株用Mega 5.0 软件建立系统进化树;将全基因组测序的47个序列片段提交到BAGEL4(http：//bagel.molgenrug.nl/)与数据库进行比对,预测TS1含有的抗菌基因。将预测含有抗菌基因的序列片段用SnapGene 4.3.6软件分析并绘图。

1.5 菌株的形态以及生化鉴定试验

将TS1菌株按照革兰氏染色试剂盒的说明书进行染色镜检观察其形态;将纯化的TS1菌液按生化鉴定管说明书接种于不同细菌生化鉴定管中,于37 ℃恒温培养箱培养24 h,观察结果并参照细菌生化鉴定编码册进行鉴别。

1.6 菌株的生长曲线测定及耐酸、耐胆盐试验

将纯化的TS1菌株按10 mL·L-1的接种量接种到新鲜的LB培养基中,取200 μL菌液加入96孔板中,设置3个重复,置于37 ℃的酶标仪中,每隔1 h测量D600值,绘制生长曲线。

取50 μL纯化后的TS1菌液分别加入4 950 μL pH值为3.02、4.06、5.03、6.04的LB液体培养基中,再取50 μL纯化后的菌液加入4 950 μL正常LB液体培养基中作为对照,同时放入37 ℃、160～180 r·min-1恒温振荡培养箱培养16～18 h,用酶标仪分别测量酸性培养液和对照培养液培养的菌液D600值,计算菌株存活率。

另取50 μL纯化后的TS1菌液分别加入4 950 μL牛胆盐浓度为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%的LB液体培养液中,再取50 μL活化后的菌液加入4 950 μL LB液体培养基中作为对照,同时放入37 ℃、160～180 r·min-1恒温振荡培养箱振荡培养16～18 h,用酶标仪分别测量含胆盐的培养液和对照培养液培养的菌液D600值,计算菌株存活率。

1.7 不同抗菌药物对TS1菌株的抑菌活性

用无菌生理盐水将TS1纯化菌液稀释至0.5麦氏浓度(约1×108CFU·mL-1),将稀释后的TS1菌液均匀铺于LB固体培养基中,选取六大类15种抗菌药物,用K-B药敏纸片法[15]间隔一定距离贴药敏纸片(具体型号见表1),于37 ℃恒温培养18 h后测量抑菌圈平均直径(mm),参照CLSI M100ED30的结果判读标准[16]描述TS1耐药结果。

表1 药敏纸片信息Table 1 Information on susceptibility test disk

1.8 TS1菌株的体外抑菌试验

以大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC58785)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、猪链球菌(WH1609)作为指示菌,采用琼脂扩散打孔法测定抑菌圈,每组设置3个重复。将100 μL指示菌均匀铺于LB固体培养基中,打孔后在孔中加入50～80 μL的纯化TS1菌液,37 ℃恒温培养24 h,测量抑菌圈直径,以抑菌圈平均直径(mm)描述抑菌效果。

选取革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的代表菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC25922)作为指示菌进行后续试验。将纯化后的菌液放入高速冷冻离心机中5 000 r·min-1离心 5 min 获得菌体和上清液,用无菌PBS清洗菌体1～2次保证菌体的纯度。然后采用打孔法设置试验分组：阴性对照组、TS1全菌液组、上清液组以及菌体组,37 ℃培养24 h,进行TS1菌体和上清的抑菌试验,以有无抑菌圈判定其抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 短小芽胞杆菌TS1 16S rRNA PCR扩增与系统进化树分析

从49株益生菌中分离、筛选得到1株各方面性能相对比较好的菌株,将其命名为TS1,并保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为NO.2022538。TS1 16S rRNA PCR扩增结果(图1-A)显示：在1 000～2 000 bp处出现明显条带,且阴性对照组没有出现条带。系统发育树结果见图1-B,BLAST分析发现与TS1 16S rRNA同源性高于99%的菌株均属于短小芽胞杆菌,且与BacilluspumilusEE112-P4聚在一支。

图1 TS1 16S rRNA PCR扩增结果与系统进化树分析Fig.1 Results of TS1 16S rRNA PCR amplification and phylogenetic tree analysis A. TS1 16S rRNA PCR扩增结果(con为阴性对照,LB和Landy代表不同的液体培养基,M为DNA标准品);B. 基于菌株TS1及相关菌株的16S rRNA序列采用邻接法建立的系统发育树。A. TS1 16S rRNA PCR amplification results(con is the negative control,LB and Landy represent different liquid medium,M indicates DNA marker);B. Phylogenetic tree established using neighbour-joining method based on 16S rRNA sequence of strain TS1 and related strains.

2.2 TS1菌株的形态以及生化鉴定结果

TS1革兰氏染色为阳性,细菌形态为单个、短直、杆状(图2-A);TS1在LB培养基上生长状况良好,菌落形态大多为直径2～3 mm中间稍有凹陷的圆形或者椭圆形(图2-B);将TS1分别接种不同的生化反应鉴定管,按说明书进行培养,根据生化鉴定结果(表2)并对照细菌生化鉴定编码册确定该菌株为短小芽胞杆菌。

图2 TS1革兰氏染色结果及菌株形态Fig.2 TS1 Gram staining results and strain morphologyA. 革兰氏染色结果Gram staining results;B. TS1的菌落形态Colony morphology of TS1.

表2 TS1的生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of TS1

2.3 TS1的生长曲线测定及耐酸耐胆盐试验

用酶标仪每隔2 h测定TS1 48 h的生长曲线(图3-A),结果显示,TS1在培养约4 h进入对数生长期,繁殖快速,菌体浓度增加,在22 h左右到达平台期且48 h仍然保持稳定,说明稳定期的维持时间长;由图3-B 和C可知,TS1在低pH值和高胆盐含量下存活率仍然较高,说明TS1能在畜禽的胃以及肠道中存活。

图3 TS1的生长曲线及耐酸、耐胆盐结果Fig.3 Growth curve of TS1 and results of acid and bile salt resistanceA. TS1 48 h生长曲线;B. TS1在不同pH下的存活率;C. TS1在不同胆盐含量下的存活率。A. TS1 48 h growth curve;B. Survival rate of TS1 at different pH value;C. Survival rate of TS1 at different bile salt content.

2.4 TS1的药敏试验结果

由表3可知,短小芽胞杆菌TS1对β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢1/2/3/4代中常用的代表性药物中的复方新诺明、阿米卡星、氧氟沙星、氨苄西林、青霉素、庆大霉素、多西环素、环丙沙星、阿莫西林、美罗培南和头孢唑林极敏,对头孢他啶产生耐药,对头孢噻肟和头孢吡肟中度敏感,对头孢呋辛高度敏感。

表3 短小芽胞杆菌TS1的药敏试验结果Table 3 Results of the drug sensitivity test of Bacillus pumilus TS1

2.5 TS1的体外抑菌试验结果

由图4可知：短小芽胞杆菌TS1对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌4种指示菌(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌各2种)均产生较明显的抑菌作用,抑菌直径分别为18、21、28和23 mm,对革兰氏阳性菌的抑菌作用更明显,阴性对照组无抑菌圈(图4-A—D),说明TS1产生了抑菌产物;全菌液和菌体对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌都产生了抑菌圈,上清液以及阴性对照组无抑菌圈(图4-E、F),这可能与TS1的培养条件有关。

图4 短小芽胞杆菌TS1体外抑菌试验结果Fig.4 Results of in vitro inhibition test of Bacillus pumilus TS1 A. TS1对大肠杆菌的抑菌结果;B. TS1对沙门氏菌的抑菌结果;C. TS1对金黄色葡萄球菌的抑菌结果;D. TS1对猪链球菌的抑菌结果;E. TS1的全菌液、上清液、菌体沉淀以及阴性对照LB肉汤对大肠杆菌的抑菌结果;F. TS1的全菌液、上清液、菌体沉淀以及阴性对照LB肉汤对金黄色葡萄球菌的抑菌结果。A. Inhibition results of TS1 against Escherichia coli;B. Inhibition results of TS1 against Salmonella;C. Inhibition results of TS1 against Staphylococcus aureus;D. Inhibition results of TS1 against Streptococcus suis;E. Inhibition results of TS1 in whole solution,supernatant,bacterial precipitate and negative control LB broth against Escherichia coli;F. Inhibition results of TS1 in whole solution,supernatant,bacterial precipitate and negative control LB broth against Staphylococcus aureus.

2.6 TS1的全基因组测序结果

由图5可知,TS1基因全长为3 646 887 bp,GC含量约为42.09%。BAGEL4中的结果显示其产生的抗菌肽与Amylocyclicin较为相近,且与数据库里的抗菌肽比对后发现相似度只有48.90%,说明TS1产生的抗菌肽可能是一种新型抗菌肽。

图5 短小芽胞杆菌TS1全基因组测序及分析结果Fig.5 Sequencing and analysis results of the whole genome of Bacillus pumilus TS1A. TS1全基因组圈图;B. TS1中的Amylocyclicin位置以及与基因库对比的相似性;C. Amylocyclicin基因簇。A. Sketch of the whole genome of TS1;B. Amylocyclicin location in TS1 and similarity to gene bank comparison;C. Amylocyclicin gene cluster.

3 讨论与结论

畜禽养殖中细菌耐药性问题已日益严峻,对抗生素替代品的筛选和研究刻不容缓。益生菌添加剂不仅可以促进动物生长,还可抑制致病菌,同时通过调节畜禽肠道菌群维持肠道上皮稳态,从而促进畜禽肠道健康[17-19]。目前市面上所售动物用益生菌产品大多数为枯草芽胞杆菌(Bacillusubtilis),少数为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)等[20]。本试验从健康牦牛粪便中分离鉴定出了一株具有益生潜力的短小芽胞杆菌TS1。芽胞杆菌属在恶劣的环境中可以形成芽胞而存活,因此具有抗逆性好、易保存的优点。有研究表面,芽胞杆菌属因容易在畜禽肠道中定殖而发挥益生作用[21]。

畜禽养殖中可以应用的益生菌应具备生长性能强、耐受恶劣环境的特点,因此筛选出具有耐受强酸性、高胆盐含量以及高温条件的菌株具有重要意义。本试验筛选的短小芽胞杆菌TS1在pH3左右时的存活率为31.4%,在牛胆盐浓度为0.3%时的存活率为65.4%,说明其具有较强的耐酸、耐胆盐能力。畜禽胃中大多为强酸环境,肠道中的胆盐含量为0.05%～0.3%,TS1具有较强的耐酸耐胆盐能力,足够数量的TS1可以通过胃肠,从而占据肠道生态位抑制致病菌的定殖,减少致病菌侵害[22]。

TS1体外抑菌试验结果表明,TS1菌全菌液和离心后的菌体对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有一定的抑菌作用。有研究表明短小芽胞杆菌发挥抑菌作用可能是各种酶在发挥作用[23-24],也有研究认为是细菌素的作用[25-26]。本研究通过全基因组测序结果推测TS1发挥抑菌作用的物质可能是抗菌肽Amylocyclicin,这是一种对革兰氏阳性菌有高抗菌活性的新型细菌素[27]。Amylocyclicin是环状细菌素的一个成员,这是一类核糖体合成的多肽家族,它们因其热稳定性和高磷酸基团(PI)值而区别于其他细菌素并普遍存在于芽胞杆菌类群中[28]。在许多革兰氏阳性细菌中都存在环状细菌素。本试验发现的Amylocyclicin与其他环状细菌素的同源性较低,如大肠杆菌的Carnocyclin[29](33.7%)、粪肠球菌的Enterocin[30](38.2%)、乳酸菌的Lactocyclicin[31](35.6%)。与同是芽胞杆菌FZB42的Amyloliquefaciens[27]相比,同源性为48.9%,TS1 Amylocyclicin的核苷酸序列与芽胞杆菌属的序列相似性为97%～99%[32]。有研究表明Amylocyclicin发挥抑菌作用的主要机制是破坏致病菌细胞壁使其形成孔洞,其内容物外泄,细菌因无法进行正常代谢而死亡[33]。因此,本试验所分离的TS1具有潜在的替代抗生素的应用价值。Suda等[34]研究表明芽胞杆菌产生抗菌肽的最适条件需采用BHI(brain heart infusion)培养基,于30 ℃有氧条件下振荡(150 r·min-1)培养。还有研究表明果糖和Landy培养基也会促进抗菌肽的产生和分泌[35-36]。我们发现TS1序列中有编码抗菌肽Amylocyclicin的基因簇,但本实验未发现TS1的培养上清液具有明显的抗菌活性,推测该基因簇需要在一定的培养条件或者合适的培养基方可大量表达,对此尚需进一步优化培养条件进行深入探究。

本研究所筛选出的牦牛源短小芽胞杆菌TS1,具备生长速度快、稳定期时间长、抗逆性强、广谱抗菌的特点,基本具备了畜禽饲料添加剂临床使用的特性,具有开发成为畜禽用饲料添加剂的潜力。在此基础上,我们发现TS1的基因组中存在一段较新的编码抗菌肽的序列,其抑菌作用可能与此抗菌肽有关,但是具体的机制还需要进一步探究。