不同月龄苏淮育肥猪纤维表观消化率、肠道长度与微生物差异分析

杜陶然,牛清,5,蒲广,李开军,刘根盛,牛培培,张总平,李强,李平华,黄瑞华*

(1.南京农业大学养猪研究所,江苏 南京210095;2.南京农业大学淮安研究院,江苏 淮安 223001;3.淮安新势畜牧服务有限公司,江苏 淮安 223001;4.淮安市淮阴新淮种猪场,江苏 淮安 223322;5.上海市农业科学院,上海 201106)

作为世界第一养猪大国,我国目前猪饲料原料以玉米、豆粕为主。在我国饲料资源逐渐匮乏,玉米、大豆等粮食作物进口量不断提高,“人畜争粮”矛盾日渐突出的情况下,寻找谷物饲料原料的替代品迫在眉睫。近年来,人们对猪饲料研究的关注点也从蛋白质和能量饲料转移到来源丰富且价格低廉的粗饲料上。因此,研究中国地方猪种的耐粗饲性能,促进中国地方猪节粮型粗饲技术的推广,可以大幅度降低饲养成本,减少浪费和污染,缓减农业资源的供需矛盾。

猪胃和小肠不能产生降解日粮纤维的酶,消化吸收粗纤维主要通过其大肠中微生物的降解来实现[1]。大肠内微生物,尤其是纤维分解菌分泌纤维素酶复合体,将纤维作为发酵底物,水解纤维素聚合体,产生单糖或寡糖,再经发酵产生乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA),最终被机体吸收利用,其中结肠中SCFA可为生长猪提供 5%～28%的能量来源[2]。

不同品种猪肠道发育存在差异,在相同生长环境中,中国地方猪品种及含有地方猪血统的培育猪种能够表现出更优的纤维适应力[3]。Fevrier等[4]对大白猪和梅山猪饲喂高粗纤维的日粮,发现梅山猪较大白猪更耐粗饲。Kemp等[5]对梅山猪与荷兰长白猪饲喂粗纤维日粮,结果同样发现梅山猪的日粮粗纤维消化率明显高于长白猪。Urriola等[6]用梅山猪和不同年龄体重的约克夏猪进行试验,在回肠末端制作篓管,测定不同品种猪饲喂不同水平日粮纤维消化率的差异,结果发现梅山猪较约克夏猪具有更高的消化道表观总消化率。

中国地方猪品种的耐粗特性可能与其肠道发育有关。Fevrier等[4]发现梅山猪较大白猪有更强的粗纤维消化能力的优势缘于梅山猪拥有更重的胃肠道。Urriola等[6]研究也认为,梅山猪对高纤维日粮消化率更强的原因,与梅山猪大肠相对质量更重紧密相关。Yen等[7]研究也证实梅山猪胃肠道质量显著大于大白猪。程泽信等[8]通过对野猪和长白猪内脏器官的观察发现,野猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠的长度宽度均比长白猪大,且质量也比长白猪大,说明野猪的耐粗饲能力强。宋青龙等[9]对8月龄野猪和长白猪的研究发现,野猪消化道主要器官胃、小肠、大肠、肝和胰的相对长度或相对质量均高于长白猪。特别是与消化有关的小肠的相对质量、大肠的相对长度两指标达到了极显著的水平。

除肠道发育外,肠道微生物也是影响猪纤维消化能力的重要因素。Fevrier等[4]发现梅山猪较大白猪更耐粗饲的原因是梅山猪拥有更丰富的大肠微生物。Urriola等[6]研究也发现,梅山猪大肠内活跃的纤维降解菌对不同纤维日粮消化能力不同,其具体的微生物学机制尚未明晰。目前明确影响纤维消化率的微生物报道不多,其中白化瘤胃球菌、柔嫩梭菌是常见的纤维分解菌[10]。

猪的纤维降解能力也与日龄有关,许多研究表明猪的日龄越大,其利用纤维的能力越强。Bindelle等[10]运用体外发酵方法发现不同年龄阶段不同体重猪肠道菌群的发酵能力不同;Urriloa等[6]也发现 102 kg 的大白猪对干酒糟及其可溶物中的粗纤维(crude fiber,CF)表观总消化率显著高于80 kg的大白猪。本实验室前期对28、60、90和150 d苏太猪的纤维表观消化率进行了分析,发现CF和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)的表观消化率在 150 d 时最高,且与年龄成正相关;90 d组中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)表观消化率极显著高于60 d组,与150 d组无显著性差异[11],但育肥后期(7、8月龄)的纤维消化能力是否存在差异未知。

苏淮猪是我国新近培育成功的瘦肉型猪种,含有75%大白血统和25%淮猪血统,具备其父本大白猪瘦肉率高的特点,又保留其母本淮猪“耐粗”的特性。本课题组前期研究表明,苏淮猪可以适应35%的全脂米糠高纤维日粮[12-13],而且用12.77%脱脂米糠替代部分育肥日粮中的玉米对苏淮猪生长性能和营养物质表观消化率无显著影响[14],初步证明苏淮猪的耐粗特性。苏淮猪的商品销售以优质肉为主,适度控制其生长速度,不在6月龄上市,延长饲养期是生产优质肉的有效手段,因此苏淮猪育肥猪一般7或8月龄上市。但苏淮猪育肥后期(7、8月龄)的纤维消化能力是否存在差异未知,其纤维消化率能力与其肠道发育和肠道常见纤维分解菌关系有待确定。因此,本课题比较了7、8月龄苏淮猪的各类纤维表观消化率与肠道发育的差异,并将纤维表观消化率与肠道长度、周长进行了相关性分析,探究苏淮猪肠道发育与纤维消化能力之间的关系。并使用real-time PCR技术,研究7、8月龄高、低纤维消化率苏淮猪盲肠和结肠内白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌2种常见纤维分解菌的丰度差异。本研究为探究7、8月龄苏淮猪纤维消化能力提供数据,为改良苏淮猪日粮配方,降低养殖成本提供理论依据,为我国地方猪种及含地方猪种血缘的培育猪种育肥后期的耐粗饲特性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

在江苏省淮安市淮阴种猪场选取82头出生条件相似的苏淮猪,随机分为2组,在相同饲养环境下饲养,在7、8月龄时分别进行屠宰。采集结肠后端内容物样品,保留2管微生物样品,其余制成风干样待检,测定不同月龄猪结肠后段各营养成分的表观消化率。测定不同月龄猪肠道(大肠、小肠及肠道总长)长度、周长,进行消化率与肠道长度、周长的相关性分析。再根据结肠后段纤维的表观消化率,分别在7、8月龄猪中选取高纤维消化率组和低纤维消化率组各5头进行盲肠、结肠内容物微生物Real-time PCR测定。饲养试验在江苏省淮安市淮阴种猪场进行。饲料均未添加抗生素。

1.2 试验动物饲养管理

试验猪每日饲喂2次,时间分别为08：30—09：30和14：30—15：30。试验过程采用干料饲喂,饲喂时间段自由饮食,全天自由饮水,日常管理与防疫按照场内生产常规进行,试验猪只屠宰前2个月均未使用抗生素治疗。试验日粮成分如表1所示。

表1 试验日粮原料组成和营养组成Table 1 Ingredient composition and nutrient composition of the experimental diet %

1.3 屠宰试验

将2组猪只饲养至7月龄(210±7)d和8月龄(240±7)d,禁食12 h后运送至淮安苏食肉品有限公司进行屠宰,期间允许自由饮水。采用宰前电击晕法及颈部大血管放血法进行屠宰。所有试验程序、动物饲养和屠宰均按照南京农业大学动物福利与伦理委员会制定的《实验动物饲养与使用指南》[认证号：SYXK(苏)2017-0007]进行。

1.4 营养成分表观消化率的测定

猪只屠宰后,采集结肠后端内容物样品,每200 g内容物加入15 mL 10%硫酸溶液混合均匀,-20 ℃储存。将内容物样品65 ℃烘干后用粉碎机粉碎过40目筛,105 ℃烘干至恒重后进行各营养物质的表观消化率测定。采用《饲料中盐酸不溶灰分的测定：GB/T 23742—2009》的方法测定盐酸不溶灰分(acid insoluble ash,AIA)含量;采用Kjeltec8400 FOSS全自动凯氏定氮仪测定粗蛋白(crude protein,CP)含量;采用《食品中脂肪的测定：GB/T 5009.6—2003》的索氏抽提法测定粗脂肪(ether extract,EE)含量。采用《动物饮料和宠物食品中的(粗)纤维：AOAC 962.09》的方法测定粗纤维(crude fiber,CF)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)含量。消煮器为ANKOM A200i半自动纤维分析仪。营养成分(CP、EE、CF、NDF、ADF)表观消化率(%)=100×[1-(饲料中AIA的含量×粪便中的该营养成分含量)/(粪便中AIA的含量×饲料中的该营养成分含量)]。

1.5 肠道指标的测定

猪屠宰后迅速剖开腹腔,取出完整胃肠道,保留其中内容物,将各肠段分界处双结扎,肠段分段,分离出小肠(含十二指肠、空肠、回肠)、盲肠、结肠,在自然伸展状态下,用皮尺测量小肠、大肠的绝对长度。双手平托盲肠使其处于自然状态,选择盲肠最宽处,使用软绳紧贴肠道环绕1周,再测量软绳长度即为盲肠周长。在测量大肠长度时确定大肠中间点,双手平托中间点周围结肠使其处于自然状态,使用软绳紧贴肠道环绕1周,再测量软绳长度即为结肠周长。

1.6 肠道纤维分解菌数量测定

根据结肠后段纤维的表观消化率结果,分别从7、8月龄猪中选取高纤维消化率组和低纤维消化率组各5头进行盲肠、结肠内容物肠道纤维分解菌丰度测定。使用TIANamp Stool DNA Kit(DP328)提取盲肠、结肠内容物DNA。白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的引物序列、扩增片段长度及来源文献见表2。

表2 PCR引物及相关参数Table 2 PCR primer and parameters

根据上述特异性引物以及最适退火温度对于不同细菌进行PCR扩增。利用PCR产物片段纯化试剂盒对扩增产物进行回收纯化后进行Vector载体连接与目的片段的克隆。使用质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒。PCR产物经12 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度,然后经过DNA产物纯化试剂盒纯化后测定PCR产物的浓度。拷贝数计算公式：

拷贝数=c×10-9×6.02×1023/(660×X)

(1)

式中：c为DNA浓度(ng·μL-1);X为目的片段长度。再利用ABI 7300 Real-time PCR仪对结肠内容物中总细菌及相关微生物数量进行定量分析。

将2种细菌的标准样品和待测样品同时进行PCR反应,绘制标准曲线。以不同拷贝数的阳性模板的对数为纵坐标,以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(CT)为横坐标绘制标准曲线。待测样品和标准曲线进行比较,获得各样品中2种细菌的绝对数量。

1.7 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2010软件进行初步整理,用SPSS 19.0软件包ANOVA进行单因素方差分析,并进行相关性分析。试验结果以平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同月龄苏淮猪营养物质表观消化率指标差异分析

如图1所示,8月龄苏淮猪的CP、EE、CF、NDF、ADF的表观消化率均显著高于7月龄(P<0.05)。

图1 7月龄(n=42)和8月龄(n=40)苏淮猪营养成分表观消化率的差异比较Fig.1 Comparison of nutrient digestibility of Suhuai pigs at 7 months(n=42)and 8 months age(n=40) CP：Crude protein;EE：Ether extract;CF：Crude fiber;NDF：Neutral detergent fiber;ADF：Acid detergent fiber. *P<0.05;**P<0.01. The same as follow.

2.2 不同月龄苏淮猪肠道指标差异分析

如图2-A所示,苏淮猪7、8月龄大肠(盲肠与结肠)长度、小肠(十二指肠、空肠、回肠、盲肠)长度及肠总长指标均无显著差异。苏淮猪7、8月龄盲肠周长及结肠周长指标均无显著差异(图2-B)。

图2 苏淮猪肠道长度(A)和周长(B)在7、8月龄之间的差异比较(n=42)Fig.2 Comparison of the intestinal length(A)and circumference(B)of Suhuai pig between 7 months and 8 months age(n=42)

2.3 肠道指标与营养成分表观消化率相关性分析

由表3可知,盲肠周长与EE、CF、和ADF的表观消化率显著正相关(P<0.05)。其他肠道指标与EE、CF、和ADF的表观消化率均无显著相关性。

表3 肠道指标与肠道中营养成分消化率的相关系数(n=82)Table 3 Correlation coefficient between intestinal index and nutrient digestibility of intestinal tract(n=82)

2.4 7和8月龄高、低纤维消化率组的盲肠和结肠微生物丰度差异性分析

由2.1节结果可知,日龄对苏淮猪结肠后段纤维消化率影响显著,而且日龄对肠道微生物有影响。因此,为排除日龄的影响,根据结肠后段纤维的表观消化率,分别在7、8月龄猪中选取NDF表观消化率最高和最低的苏淮猪各5头,进行盲肠、结肠内容物常见纤维分解菌丰度测定。结果如表4可知：7月龄与 8月龄高纤维消化率组的各营养成分表观消化率均极显著高于低纤维消化率组(P<0.01);在高纤维消化组中,8月龄的NDF、ADF消化率显著高于7月龄,而低纤维消化组中7、8月龄间表观消化率无显著差异。由图3可知,7月龄和8月龄高、低纤维消化率苏淮猪组间的盲肠、结肠中白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度均无显著差异。7月龄苏淮猪的结肠柔嫩梭菌丰度在高、低纤维消化率组均显著高于盲肠(P<0.05)。低纤维消化率组苏淮猪的结肠柔嫩梭菌丰度在8月龄时显著低于7月龄(P<0.05)。

图3 7和8月龄高、低纤维消化率组苏淮猪的盲肠和结肠微生物丰度(n=5)Fig.3 The bacterial abundance of different fiber digestibility groups at 7 months and 8 months age of Suhuai pig(n=5)

表4 高、低纤维消化率组苏淮猪的结肠营养成分的表观消化率(n=5)Table 4 The nutrient digestibility of high and low NDF digestibility groups of Suhuai pig(n=5) %

3 讨论

3.1 营养成分表观消化率指标分析

本试验中8月龄苏淮猪对粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的表观消化显著高于7月龄。猪是单胃杂食动物,对不同饲料同一营养物质消化率不同,不同生长阶段猪消化道的结构、功能、长度和容积的变化对饲料的消化力也不一样。随着年龄的增长,猪消化器官和机能发育日趋完善,对饲料蛋白质、脂肪、粗纤维的消化率也随之上升,尤以粗纤维最为明显[15]。研究表明,油脂的利用率随动物年龄的变化而变化,动物越小,对脂肪的利用率越低[16]。由于幼龄动物的消化系统仍处于生长完善过程中,其与油脂消化相关的胆汁分泌、消化酶分泌及活性都不足,因而对日粮脂肪的消化吸收率也较低。研究证实,猪日龄越大,利用纤维的能力越强。Renteria-Flores[17]发现由于后备母猪没有达到它们的成熟年龄,一方面胃肠道容积小于经产母猪,另一方面与经产母猪相比,胃肠道菌群发育还不够完善,因此经产母猪对纤维的消化率高于后备母猪;Noblet等[18]发现成年猪对纤维性饲料的消化率远高于生长猪;Fernndez等[19-20]也证实成年母猪后肠微生物活性高于生长猪;Le Goff等[21]也证实母猪消化发酵纤维的能力比生长猪强。下一步试验可以从肠道形态、微生物方面考虑,进一步探究产生这一变化的原因。

3.2 肠道指标与表观消化率相关性分析

大肠,特别盲肠是猪主要的发酵器官[22],Bach-Knudsen等[23]研究表明,盲肠及结肠对碳水化合物的发酵量占大肠总发酵量的92%,可见猪大肠的微生物发酵主要集中在大肠的前部。猪大肠的消化细菌主要分布在盲肠,淀粉分解菌和纤维分解菌占主要的优势。小肠对纤维的消化率较低(低于25%),纤维进入大肠后的消化率高(大于85%),因此,猪盲肠中纤维分解菌对进入大肠的消化残渣有十分重要的消化作用[24]。不同生理阶段的猪对纤维利用率差异主要取决于肠道容积大小及大肠微生物的发酵能力,而肠道的发育与肠道微生物也有密切的关系。从相关文献的一些数据可以看出,一个品种或品系的消化性能往往与其消化道的形态结构存在联系[4,12]。本试验中盲肠周长与粗纤维、ADF的表观消化率呈显著正相关。关于盲肠长度与粗纤维消化率之间的相关性研究并不多,秦贵信等[25]认为一般消化道较重、较长或容积较大者,食糜在体内存留的时间较长,饲料养分的消化率也较高。在消化道结构上,品种间的差异在大肠上表现较明显。因为猪饲料粗纤维的主要消化吸收部位是后段消化道,因此,在养分消化率方面,品种间的差异在粗纤维上表现最大。猪种间消化性能差异在消化道形态结构和生理机能上也表现出一致性。推测试验中导致这一结果的原因可能是盲肠容积增加使纤维分解菌定殖增加,导致消化率升高。但盲肠长度也是一个重要的因素,本试验没有单独测量盲肠长度,无法说明这一点。

3.3 苏淮猪7、8月龄高、低纤维消化率组肠道纤维分解菌差异

猪通过大肠中微生物的发酵作用消化日粮纤维,这些微生物在猪盲肠和结肠中数量最多,纤维类物质被多种纤维降解菌产生的纤维降解酶降解。猪肠道内纤维降解菌主要有黄化瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白化瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)等[26-27]。研究表明,纤维类型对猪后肠中白化瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)数量变化无显著影响,对黄化瘤胃球菌(Rumincoccusflavefaciens)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)和梭菌Ⅳ群(ClostridiumclusterⅣ)的数量变化存在显著影响[28],且不同肠段间也有一定差异。

不同细菌具有的基因拷贝数不同,而目前对于肠道中各种细菌基因组基因拷贝数的认识有限[29]。因此,对于不同菌株构成的某类细菌群体的准确数量目前难以测定,一般用其基因拷贝数来估算[30]。本试验进一步以等梯度稀释的标准品为模板,用作定量分析,标准品扩增值与目标细菌的拷贝数间呈线性相关。所有猪饲喂同一种日粮并饲养于同一环境,这样可减少遗传背景、日粮和环境等对试验的影响。在对相关纤维分解菌的定量研究中,7月龄和8月龄高、低纤维消化率苏淮猪组间的盲肠、结肠白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度均无显著差异。造成定量结果无差异的原因可能是其他未知的纤维分解菌与苏淮猪耐粗特性相关,同时也有可能是受试验样本数较少的影响。下一步需要寻找其他未知的与苏淮猪纤维表观消化率相关的纤维分解菌。