日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠屏障相关基因表达、消化酶活性和微生物菌群的影响

刘静,王钊,于昊,夏雨婷,李鹏,牛伟强,万永杰,茆达干*

(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.启东瑞鹏牧业有限公司,江苏 南通 226000)

肉羊产业是畜牧业的重要组成部分,但常规饲料资源短缺等问题阻碍了肉羊产业的发展。开发非常规饲料资源、丰富饲料种类是促进养羊业可持续发展的关键。蚕豆是我国重要的粮食作物和饲料原料,然而在长江以南等蚕豆主产区,其副产物蚕豆皮未得到充分利用。蚕豆皮除常规营养成分外,含有果胶和多巴等化学成分,并富含膳食纤维及原花青素等生物活性物质。研究表明,在动物饲料中添加一定比例的蚕豆皮膳食纤维,有利于促进肠道蠕动、吸收营养物质、提高动物生长性能,且蚕豆皮中的原花青素是其发挥抗氧化活性作用的主要成分[1]。豆皮可被肠道微生物利用,经肠道中的菌群发酵而发挥益生元作用,促进有益菌的增殖,抑制有害菌的增殖,维持肠道微生态平衡[2]。

研究表明,空肠上皮细胞对调节营养物质的摄取和代谢发挥着重要作用,对微生物的定殖能立刻做出反应[3],其上皮细胞可利用膳食纤维经微生物发酵产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)为反刍动物提供能量来源,并且调节肠道炎症反应[4]。肠黏膜上皮细胞彼此相连,构成完整的生物屏障,细胞质膜蛋白与接头蛋白形成的蛋白网状结构是紧密连接的重要部分[5],具有调节肠道通透性的作用。炎症细胞因子影响肠黏膜紧密连接蛋白表达和分布[6]。消化酶可促进食物中糖、脂肪和蛋白质的水解,这一过程主要发生在十二指肠和空肠段。肠道微生物结构主要受日粮组成的影响,还与外界应激和生殖激素等密切相关[7]。

本课题组前期在等能等氮的基础上,分别在基础日粮中添加不同比例的蚕豆皮日粮饲喂湖羊,结果发现日粮添加30%蚕豆皮组湖羊的生长性能显著提高。肠道是继瘤胃消化吸收后的主要营养物质吸收场所,影响反刍动物生产性能等。研究表明小肠对营养物质的消化吸收受到肠道屏障功能、消化酶活性及肠道菌群结构等因素的影响[8]。因此,本试验以湖羊空肠为对象,研究日粮添加30%蚕豆皮对黏膜屏障相关基因表达、消化酶活性和食糜微生物区系的影响,以探究改善湖羊生产性能的潜在机制,为蚕豆皮的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试验日粮

选择体况良好、体重相近[(27±2.0)kg]的4月龄雄性湖羊30只,随机分为2组(n=15),每组 3个重复,每个重复5只羊。对照组(CON)饲喂基础日粮,试验组(BBS)饲喂添加30%蚕豆皮的基础日粮。2组日粮组成和营养成分见表1。

表1 日粮组成及营养组成水平(风干基础)Table 1 Diet composition and nutritional level(air-dry basis) %

1.2 试验设计与样品采集

预试期为10 d,正式期50 d。试验期间,每天08：00和14：00各饲喂1次,自由采食和饮水。试验结束,每组选择中位体重的5只羊屠宰(n=5),宰前禁食24 h、禁水2 h,颈动脉放血屠宰。解剖后采集空肠组织样品和食糜于冻存管中,干冰保存带回实验室-80 ℃冷冻保存,用于后续肠黏膜屏障相关基因、消化酶活性和食糜微生物测序试验。

1.3 试验样品测定

1.3.1 空肠黏膜屏障相关基因表达量应用RT-qPCR检测空肠黏膜屏障相关基因mRNA相对表达量,包括闭合蛋白1基因(Claudin-1)、闭锁蛋白基因(Occludin)、黏蛋白2基因(mucoprotein-2,MUC-2)、闭合小环蛋白基因(zonula occludens-1,ZO-1)、白细胞介素6基因(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素10基因(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素1β基因(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α基因(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)。使用RNA提取试剂盒(RC112,南京诺唯赞生物科技有限公司)提取组织总RNA,反转录试剂盒(R323-01,南京诺唯赞生物科技有限公司)获得cDNA,定量试剂盒(Q311-01,南京诺唯赞生物科技有限公司)检测mRNA相对表达量。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列如表2所示。对内参基因β-actin标准化后,通过2-ΔΔCT方法计算基因相对表达水平。

表2 目的基因引物序列Table 2 Primer sequences of target genes

1.3.2 空肠黏膜消化酶活性测定应用生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测空肠黏膜胰蛋白酶(A080-2)、脂肪酶(A054-2)和α-淀粉酶(C016-1)的活性,具体方法参照说明书。

1.3.3 空肠食糜微生物多样性测定从空肠食糜样品中提取微生物组样本总DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量和浓度。参照Logue等[9]的方法设计引物序列并进行PCR扩增,产物经纯化和定量,扩增子池用于测序,利用Illumina NovaSeq 6000测序仪进行测序。测序原始数据经特定条件过滤筛选得到扩增序列变体特征序列(amplicon sequence variant,ASV)和ASV丰度表,去除序列数为1的ASV,利用QIIME2软件统计微生物群落的α和β多样性。多样性测定由杭州联川生物技术股份有限公司完成。

1.3.4 生物信息学分析根据ASV序列文件,采用SLIVA数据库和NT-16S数据库进行物种注释,并根据ASV丰度表对各物种在各样本中的丰度进行统计。注释置信度阈值为0.7。基于PICRUSt 2功能预测结果,得到来自KO等数据库功能注释结果,以展示丰度差异显著的功能。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠黏膜屏障相关基因表达的影响

由表3可知：日粮添加30%蚕豆皮(BBS)组湖羊空肠中编码细胞连接相关基因Claudin-1、Occludin、MUC-2、ZO-1 mRNA水平较对照组(CON)无显著变化(P>0.05),编码炎症因子相关基因IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平较对照组无显著变化(P>0.05),但IL-1βmRNA水平在BBS组中显著降低(P<0.05)。

表3 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠屏障相关基因表达的影响Table 3 Effects of dietary broad bean skin(BBS)on jejunum barrier-related gene expressions in Hu sheep

2.2 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠黏膜消化酶活性的影响

由表4可知：日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠黏膜α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性均无显著影响(P>0.05)。

表4 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠黏膜消化酶活性的影响Table 4 Effects of dietary BBS on the activity of digestive enzymes in the jejunum mucosa of Hu sheep U·mg-1

2.3 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠食糜微生物多样性的影响

韦恩(Venn)图反映肠道内容物样品的操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)数目。每组各检测4个样本(2组各有1个样本菌群含量过少,均未上机进行后续测序)。由图1可知：CON组和BBS组分别有1 445和549个特异OTU,其中417个为共同OTU。不同分组肠道菌群组成的OUT指数存在显著差异。空肠食糜细菌的主成分分析结果如图2,主成分1和2的贡献率分别为87.08%和5.79%。同一组别内样品间距离较近,不同组别样品间的距离也较近,说明2组湖羊空肠食糜菌群结构相似。由表5可知：CON的Shannon、Chao1和Observed_otus指数显著高于BBS组(P<0.05),2组覆盖率均在99%以上。

图1 食糜微生物韦恩图Fig.1 Venn diagram of chyme

图2 主成分分析图Fig.2 Principal components analysis(PCA)diagram

表5 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠食糜微生物α多样性的影响Table 5 Effects of dietary BBS on the microbial alpha diversity of jejunum chyme in Hu sheep

2.4 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠食糜微生物菌群结构和功能的影响

2.4.1 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠食糜微生物菌群结构的影响有效序列不同分类水平的物种注释统计结果如表6,以相对丰度≥1%为准,低于1%的菌门归为其他。由表6可知：CON组的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria),BBS组的优势菌门除上述菌门之外还有软壁菌门(Tenericutes)。相比对照组,BBS组变形菌门的相对丰度较显著增加(P<0.05),厚壁菌门和髌骨细菌门的相对丰度显著降低(P<0.05)。

表6 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠食糜细菌门水平丰度的影响Table 6 Effects of dietary BBS on the abundance of jejunum chyme bacteria in Hu sheep at the phylum level %

在属水平上,对相对丰度在前30的菌属进行统计,其中相对丰度在1%左右的有14个菌属。如表7所示：BBS组的克里斯滕森氏菌R7菌群(Christensenellaceae_R-7_group)、未分类厚壁菌属(Firmicutes_unclassified)、糖单胞菌属(Candidatus_Saccharimonas)、糖酵解菌属(Saccharofermentans)、毛螺菌NK3A20菌群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)和聚乙酸菌属(Acetitomaculum)的相对丰度显著降低(P<0.05)。

表7 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠食糜细菌属水平丰度的影响Table 7 Effects of dietary BBS on the abundance of jejunum chyme bacteria in Hu sheep at the genus level%

2.4.2 菌群功能预测分析利用16S rDNA预测工具PICRUSt 2软件对这2组样品的微生物进行功能预测,参考KO数据库并对预测的功能类别进行注释,结果如图3所示,2组湖羊空肠细菌注释到的KO分析隶属于30个功能类别,丰度较高的功能预测为脂肪酸β氧化、原儿茶素降解Ⅱ、三羧酸循环Ⅴ、L-亮氨酸降解Ⅰ、脂肪酸回收、三羧酸循环Ⅰ,且BBS组显著高于对照组(P<0.05)。

图3 KEGG功能注释Fig.3 KEGG functional note

3 讨论

3.1 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠黏膜屏障相关基因表达量的影响

肠道屏障是机体一道重要的屏障,可以帮助机体抵御外界的有害物质。环境的更换以及饲养管理的转变,可能影响肠道功能,使肠道屏障受损。紧密连接蛋白如Claudin-1、Occludin、ZO-1等具有调节肠道通透性的作用,蛋白表达上调时,可降低肠道通透性,防止细菌移位,增强肠道屏障功能[10]。分泌型黏蛋白MUC2是肠上皮细胞分泌的一种高分子质量糖蛋白,肠道黏膜屏障受损会导致MUC2表达量下调。山羊运输应激2和6 h后空肠Claudin-1、Occludin和ZO-1基因表达量极显著上升[11]。日粮添加钼降低了小尾寒羊空肠Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达量[12]。IL-1β、TNF-α和IL-6是介导炎症反应的关键细胞因子,三者会使肠黏膜紧密连接蛋白表达和分布发生变化,表达量升高引起肠道通透性增加,因此,降低这些因子的含量可提高肠道屏障功能。而IL-10是由各种细胞分泌的重要抗炎细胞因子,可抑制TNF-α的释放,对维持肠道免疫稳态至关重要[13],在控制和消除炎症中起重要作用[14]。蚕豆皮富含原花青素,原花青素具有抗炎和抗菌的作用,能调节机体免疫反应[15],降低氧化应激导致的肠黏膜损伤[16],从而改善动物健康状况,促进生长。当面临饮食结构改变的压力时,动物肠道容易受到刺激,导致紧密连接蛋白的分解或降低,从而增加上皮通透性,引起局部炎症[17]。本试验中,日粮添加30%蚕豆皮并未显著改变Claudin-1、Occludin、ZO-1、MUC-2的mRNA水平,说明湖羊对添加蚕豆皮日粮的适应效果较好,并未因饲料结构的改变而产生不良反应,未对肠道造成生理损伤。湖羊采食添加蚕豆皮日粮后空肠黏膜IL-1β表达量降低,可能蚕豆皮中原花青素具有抗炎作用,保护机体肠道的免疫功能,具体机制有待进一步研究。

3.2 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠消化酶活性的影响

肠道消化酶活性的高低可反映反刍动物采食性能,同时还能直接决定肠道对营养物质吸收和利用的程度。机体的消化功能与其胃肠道所产生的消化酶活性及其分泌量呈正相关,继而影响动物的生长发育。动物自身能够合成淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等消化酶,且不同肠段消化酶活性不同。小肠内消化酶活性受日粮淀粉、脂肪和蛋白质进食量的影响[18]。周力等[19]使用不同比例棕榈粕替代玉米饲喂藏羊,结果表明0%组空肠食糜的α-淀粉酶和脂肪酶活性显著或极显著小于15%组,提示日粮脂肪含量的高低影响脂肪酶的活性。此外,在小麦饲料中添加0.2%木聚糖酶可提高高原型藏羊的空肠α-淀粉酶活性[20]。研究表明,当精粗比和营养成分含量达到一定水平后,改变日粮结构不会提高胰蛋白酶和脂肪酶活性[21]。曲星梅等[22]研究表明,6月龄绒羊空肠胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性随日粮能量和蛋白水平变化,当升高到一定营养水平,肠道消化酶活性不再上升。本试验中,2种日粮的粗蛋白、能量和脂肪含量水平在湖羊需要范围内,且含量接近,这可以解释日粮添加30%蚕豆皮不影响空肠段淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的结果。

3.3 日粮添加蚕豆皮对湖羊空肠微生物菌群结构和功能的影响

肠道菌群在促进肠道形态结构发育、维持正常免疫功能及抵御外源致病因子侵袭方面发挥重要作用[23]。Shannon、Simpson、Chao1和Observed_otus指数反映样本中物种丰富度和均匀度,Goods coverage反映微生物覆盖率,其数值越高,则样本中新物种没有被测出的概率越低。本试验中测序覆盖率接近100%,说明测序样品取样较准确,可以真实地反映湖羊空肠微生物多样性和群落结构[24]。本研究发现CON组微生物多样性和数量高于BBS组,表明日粮添加蚕豆皮后降低了肠道微生物多样性。湖羊正常肠道菌群在生长过程中与宿主和环境相互适应,容易受到饮食和环境的影响,BBS组较对照组肠道菌群OUT数量显著降低,这可能与添加蚕豆皮后日粮营养结构发生改变,营养成分丰富度降低有关。

研究表明,牛羊小肠中的变形菌门丰度较高。Zhang等[25]对小尾寒羊肠道微生物研究后发现,空肠中存在丰度较高的厚壁菌门和蓝藻菌门,在属水平上乳酸菌、瘤胃球菌和聚乙酸菌的丰度较高。变形菌门包括许多肠道致病菌类别[26],如大肠杆菌等;但变形菌门下的菌群种属并非都是致病菌类,部分也可对有关糖类代谢和蛋白表达的基因进行编码,从而确保肠道的正常厌氧状态[27]。姜碧薇等[28]研究表明酶菌混合处理虽提高瘤胃变形菌门的相对丰度,但并未对滩羊肠道产生不良影响。厚壁菌门是反刍动物胃肠道细菌的重要组成部分,能够分解饲粮中的纤维物质,其优势地位受日粮中纤维物质的影响[29],本试验结果与之相似,湖羊采食添加蚕豆皮日粮后,厚壁菌门丰度随总体纤维含量降低而变化。本试验中,蚕豆皮组拟杆菌门相对丰度有所提高,厚壁菌门的相对丰度降低。厚壁菌门和拟杆菌门协作消化一些动物自身无法利用的物质。潘锋等[30]试验结果表明,饲粮中添加酵母培养物和糖蜜及两者混合物降低了粪便厚壁菌门相对丰度,提高拟杆菌门相对丰度,提高肉牛的纤维降解率。髌骨细菌门、糖单胞菌属和糖酵解菌属被认为在正常肠道功能中发挥重要作用[31],其相对丰度与炎症反应呈正相关。本试验中,髌骨细菌门、糖单胞菌属和IL-1β结果变化趋势表明日粮添加蚕豆皮对肠道正常功能发挥有一定的促进作用。聚乙酸菌属能够利用瘤胃中产生的氢和单糖生成乙酸[32],沈子亮等[33]研究发现瘤胃内聚乙酸菌属相对丰度的增加改变了瘤胃发酵模式,从而影响动物的生产性能,降低乳脂率。本试验结果显示,添加蚕豆皮后降低了肠道产酸菌的相对丰度,结合本课题组前期试验中生产性能提高这一结果,日粮添加蚕豆皮可能通过影响产酸菌在瘤胃内的定殖,进而影响肠道中产酸菌的相对丰度。综上,日粮添加30%蚕豆皮制作全价配合饲料饲喂湖羊可改变空肠食糜微生物菌群组成和相对丰度。

肠道菌群可以调节肠道微生态,促进肠道营养物质的消化吸收,提高机体免疫力。本研究中功能预测到的差异菌群主要富集在三羧酸循环、脂肪酸β氧化、原儿茶酸降解和L-亮氨酸降解通路。脂肪酸是脂肪分解后的产物,经β-氧化后产生乙酰CoA和甘油,为三羧酸循环提供原料,葡萄糖和脂质的代谢是三羧酸循环中产生和转化其他化合物的重要阶段,不断为机体提供能量。原儿茶酸作为原花青素的次级代谢物,是原花青素在体内发挥生理功能的主要活性物质,具有抗炎、抗氧化和抑菌的作用[34]。L-亮氨酸对肌肉中葡萄糖摄取和脂质代谢起调节作用,防止肌肉收缩[35]。本研究结果提示,日粮中添加蚕豆皮饲喂湖羊后空肠菌群主要富集在碳水化合物代谢、能量代谢和氨基酸代谢等新陈代谢功能,表明肠道菌群对湖羊日粮营养物质代谢活动有促进作用,然而对相关通路中成员的影响程度有待进一步研究。

综上,本研究表明,日粮添加30%蚕豆皮可降低空肠黏膜炎症因子IL-1βmRNA表达水平,改变空肠食糜微生物菌群多样性和相对丰度,调节肠道发酵环境,为蚕豆皮在养羊业中的应用提供参考。