仿刺参内脏的化学成分研究

刘艳芳,李晓栋,尹秀丽,李 可*

1中国科学院烟台海岸带研究所 海岸带生物资源高效利用研究与发展中心,烟台 264003;2中国科学院大学,北京 100049

仿刺参(Apostichopusjaponicus)属棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺参科(Stichopodidae),主要分布于中国、俄罗斯、日本和朝鲜半岛等东亚国家[1]。仿刺参是棘皮动物中营养价值较高的品种之一,也是海参中最为名贵的品种,是我国传统的食材和药材,被誉为“参中之冠”[2]。仿刺参是我国北方最重要的海水养殖经济品种之一,2021年,我国仿刺参养殖面积为24.74万公顷,产量为22.27万吨,苗种生产量为601亿头,整个仿刺参产业链的价值约90亿美元[3]。

海参由海参体壁和海参内脏组成,海参的内脏主要由海参肠壁、海参生殖腺、呼吸树等组成[4]。研究表明,海参体壁富含蛋白质、氨基酸、脂肪酸,矿物质和维生素等营养物质[5]。除此之外,海参体壁还含有三萜皂苷、海参多糖、胶原蛋白、海参肽、酚类、脑苷脂类和类鞘氨醇等生物活性物质,具有潜在的抗氧化、抗癌、抗高血压、抗炎、抗血栓、抗糖尿病、抗肥胖和抗菌活性,营养和药用价值较高[6,7]。目前,在保健和医学领域,大多数研究主要以海参体壁为原料对海参功能进行开发,有关海参内脏的功能开发较少。研究表明,海参内脏同体壁一样也含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、脂肪酸、皂苷等活性成分,因此,海参内脏具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等功能,同时还具有降血糖、降血脂、益菌等功能[8],表明海参内脏也具有很高的营养和药用价值。然而,在海参产业中,海参内脏未能引起足够的重视,缺乏深度的研究,对海参内脏开发利用少之又少,导致海参内脏直接被丢弃。海参内脏中的化学成分值得深入研究与开发利用。综上所述,仿刺参内脏中的化学成分具有潜在的开发价值。为进一步深入认识仿刺参化学成分,本实验开展了仿刺参内脏乙醇提取物的化学成分研究。

1 材料与方法

1.1 材料

仿刺参于2021年4月从中国黄海海域采集,并由中国科学院烟台海岸带研究所王全超博士鉴定为Apostichopusjaponicus,解剖收集其内脏。标本(C2021-002)在-20 ℃条件下冷冻保存于中国科学院烟台海岸带研究所海岸带生物学与生物资源利用重点实验室。

1.2 仪器与试剂

Waters Pre 150半制备高效液相色谱仪(XBridge BEH C18,5 μm,19 mm×250 mm和XBridge BEH C18,5 μm,10 mm×250 mm)(美国Waters公司);Waters UPLC-Xevo G2-XSQ Tof型超高液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司);Bruker Avance III 500 NMR型核磁共振仪(瑞士Bruker公司);Buchi R-100旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);真空离心浓缩仪(北京吉艾姆有限公司)。

薄层层析硅胶板(烟台德信生物科技有限公司);薄层层析硅胶制备板(烟台江友硅胶开发有限公司);60～100目、200～300目和300～400目正相色谱硅胶(青岛海洋化工厂);反相硅胶柱层析填料RP-18(日本YMC公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(GE Healthcare公司,瑞典);茴香醛-硫酸溶液(上海国药集团化学试剂有限公司);甲醇、乙腈(色谱纯,瑞典OCEANPAK公司);甲醇、乙腈(色谱-质谱纯,美国Sigma-Aldrich公司);石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇和正丁醇(分析纯,上海国药化学试剂有限公司)。

1.3 提取与分离

收集新鲜仿刺参内脏约50 kg(湿重),用95%乙醇室温下浸泡,重复提取3次,每次浸泡7 d。合并乙醇提取液,减压回收溶剂,将乙醇提取物分散于20 L水中,依次用石油醚(40 L)、乙酸乙酯(40 L)和正丁醇(40 L)萃取3次,减压蒸干,得到石油醚相437.8 g,乙酸乙酯相78.2 g和正丁醇相260.0 g。将乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析,依次用石油醚/乙酸乙酯(V/V=50∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1)和二氯甲烷/甲醇(V/V=20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1)体系进行梯度洗脱,分成A～I九个组分,F组分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离,半制备液相色谱(乙腈∶水=32∶68,10.0 mL/min)分离纯化得到化合物1(2.6 mg,tR=33.0 min)、2(1.8 mg,tR=31.0 min)、3(1.3 mg,tR=27.0 min),经半制备液相色谱(甲醇∶水=45∶55,8.0 mL/min)分离纯化得到化合物4(3.9 mg,tR=20.0 min)。将正丁醇萃取物进行硅胶柱层析,以二氯甲烷/甲醇/水(V/V/V=15∶1∶0、10∶1∶0.1、7∶1∶0.1、5∶1∶0.2、3∶1∶0.2、2∶1∶0.3、1∶1∶0.2)进行梯度洗脱,分成A～G七个组分。取E组分以甲醇-水(20%→100%)进行反相硅胶柱层析,再将30%甲醇洗脱液经正相硅胶柱层析(以二氯甲烷-甲醇体系冲洗)进行梯度洗脱得到20个流分(E1-E20),E5、E9、E11、E12、E13、E18、E20再经过凝胶柱(甲醇冲洗)。E5组分利用半制备液相色谱(甲醇∶水= 30∶70,8.0 mL/min),分离纯化得到化合物5(5.0 mg,tR=22.0 min);E9组分利用半制备液相色谱(甲醇∶水= 15∶85,8.0 mL/min),分离纯化得到化合物10(38.6 mg,tR=5.0 min);E11组分利用半制备液相色谱(甲醇∶水= 25∶75,8.0 mL/min),分离纯化得到化合物8(28.6 mg,tR=11.0 min);E12组分利用半制备液相色谱(甲醇∶水= 30∶70,8.0 mL/min),分离纯化得到化合物6(2.1 mg,tR=20.0 min)、7(1.7 mg,tR=18.0 min);E13组分利用半制备液相色谱(甲醇∶水= 15∶85,8.0 mL/min),分离纯化得到化合物9(9.7 mg,tR=5.0 min)、12(7.3 mg,tR=7.0 min)、13(3.6 mg,tR=7.0 min);E18和E20组分利用半制备液相色谱(甲醇∶水= 15∶85,8.0 mL/min),分别分离纯化得到化合物14(11.5 mg,tR=7.0 min)和11(14.2 mg,tR=5.0 min)。

2 结果与分析

化合物1白色粉末,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z235.101 7 [M-H]-(calcd for 235.100 4,C10H19O4S),分子式为C10H20O4S,不饱和度为1;1H NMR和HSQC谱显示双键的2个CH质子信号分别为δH5.43和δH5.41,在低场处含有1个连氧次甲基CH2质子信号δH3.99,1个甲基CH3质子信号δH0.90;13C NMR和HSQC谱提示10个碳信号,包括双键碳信号(δC132.0和131.2),一个甲基碳信号(δC14.4),7个亚甲基碳信号(δC69.1,33.5,33.3,33.2,30.0,27.0,23.4)(见表1);在HMBC中(见图1),发现δH3.99(H-1)与δC27.0(C-3)有远程相关信号,δH0.90(H-10)与δC33.3(C-8)有远程相关信号,δH1.47(H-3)与δC69.1(C-1),131.2(C-5)有远程相关信号,δH1.33(H-8,H-9)与33.5(C-7)有远程相关信号,δH1.99(H-7)与δC23.4(C-9),131.2(C-5)有远程相关信号,δH5.43(H-5)与δC33.2(C-4),33.5(C-7)有远程相关信号,δH5.41(H-6)与δC33.2(C-4),33.5(C-7)有远程相关信号。在1H-1H COSY谱中(见图1),δH3.99/1.66,δH1.66/1.47,δH1.47/2.02,δH1.99/5.41,δH2.02/5.43,δH0.90/1.33,δH1.33/1.99有相关信号,确定C-1至C-10的连接顺序。双键的2个CH质子信号的耦合常数(J)为15.1 Hz,由此确定双键为E构型。综上所述,确定化合物1结构为(E)-dec-5-en-1-yl sulfate。通过SciFinder、Reaxys和中国知网数据库对该结构进行检索,结果显示化合物1为新化合物。化合物1的详细结构鉴定数据原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

图1 化合物1的1H-1H COSY与HMBC的关键信号

化合物2白色粉末,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z235.101 6 [M-H]-(calcd for 235.100 4,C10H19O4S),分子式为C10H20O4S;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.37(1H,dd,J=10.1,5.3 Hz,H-6),5.36(1H,dd,J=10.1,5.3 Hz,H-5),3.99(2H,t,J=6.5 Hz,H-1),2.08(2H,m,H-4),2.06(2H,m,H-7),1.67(2H,m,H-2),1.46(2H,m,H-3),1.33(4H,m,H-8/H-9),0.91(3H,t,J=7.1 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:69.1(t,C-1),30.2(t,C-2),27.2(t,C-3),27.9(t,C-4),130.6(d,C-5),131.4(d,C-6),28.0(t,C-7),33.3(t,C-8),23.5(t,C-9),14.5(q,C-10)。对比分析化合物1和化合物2双键质子信号的耦合常数及C-4和C-7的化学位移的差异,进一步确认化合物2的双键为Z构型,且以上数据与文献[9]报道一致,故鉴定化合物2为(Z)-dec-5-en-1-yl sulfate。

化合物3白色粉末,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z223.101 9 [M-H]-(calcd for 223.100 4,C9H19O4S),分子式为C9H20O4S;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.99(2H,J=6.6 Hz,H-1),1.66(2H,tt,J=13.1,6.7 Hz,H-4),1.53(1H,dt,J=13.3,6.7 Hz,H-7),1.40(2H,m,H-3),1.32(2H,m,H-5),1.32(2H,m,H-8,H-2),1.19(2H,m,H-6),0.88(6H,d,J=6.6 Hz,H-8/H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:69.3(t,C-1),30.8(t,C-2),27.1(t,C-3),30.6(t,C-4),28.6(t,C-5),40.3(t,C-6),29.3(d,C-7),23.2(q,C-8/C-9)。以上数据与文献[10]报道一致,故鉴定化合物3为7-methyloctyl sulfate。

化合物4白色粉末,溶于甲醇;+1.5(c0.39,MeOH),(-)-HR-ESI-MS:m/z223.101 5 [M-H]-(calcd for 223.100 4,C9H19O4S),分子式为C9H20O4S;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.87(1H,dd,J=9.4,5.8 Hz,H-1a),3.78(1H,dd,J=9.4,6.7 Hz,H-1b),1.78(1H,m,H-2),1.55(1H,m,H-6),1.42(1H,m,H-3a),1.35(2H,m,H-4),1.18(2H,m,H-5),1.13(1H,m,H-3b),0.96(3H,d,J=6.7 Hz,H-8),0.89(3H,d,J=1.0 Hz,H-7/H-9),0.88(3H,d,J=1.0 Hz,H-7/H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:74.0(t,C-1),34.5(d,C-2),34.7(t,C-3),25.9(t,C-4),40.5(t,C-5),29.3(d,C-6),23.2(q,C-7/C-9),23.1(q,C-7/C-9),17.3(q,C-8)。对比文献[11]报道数据发现该化合物为S构型,故鉴定化合物4为(S)-2,6-dimethylheptyl sulfate。

化合物5油状液体,易溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z236.093 8 [M-H]-(calcd for 236.092 3,C12H14O4N),分子式为C12H15O4N;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.27(2H,m,H-3,H-5),7.22(2H,m,H-4),7.21(2H,m,H-2,H-6),4.70(1H,dd,J=7.7,5.2 Hz,H-8),4.06(1H,q,J=6.8 Hz,H-11),3.24(1H,dd,J=13.9,5.1 Hz,H-7a),3.07(1H,dd,J=13.9,7.8 Hz,H-7b),1.21(3H,d,J=6.8 Hz,H-12);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:138.1(s,C-1),130.6(d,C-2,C-6),129.6(d,C-3,C-5),128.0(d,C-4),38.5(t,C-7),54.2(d,C-8),174.5(s,C-9),177.5(s,C-10),69.1(d,C-11),21.2(q,C-12)。以上数据与文献[12]报道基本一致,故鉴定化合物5为N-lactoyl-phenylalanine。

化合物6白色粉末,易溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z231.113 3 [M + H]+(calcd for 231.113 4,C13H15O2N2),分子式为C13H14O2N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.48(1H,d,J=7.9 Hz,H-5),7.34(1H,d,J=8.1 Hz,H-8),7.14(1H,td,J=7.1,0.9 Hz,H-7),7.05(1H,t,J=7.5 Hz,H-6),4.71(1H,q,J=6.6 Hz,H-1),3.97(1H,dd,J=12.1,5.1 Hz,H-3),3.45(1H,m,H-4a),3.03(1H,m,H-4b),1.75(3H,d,J=6.8 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:51.3(d,C-1),59.9(d,C-3),24.5(t,C-4),119.3(d,C-5),120.7(d,C-6),123.5(d,C-7),112.4(d,C-8),17.3(d,C-10),108.0(s,C-4a),127.6(s,C-4b),138.8(s,C-8a),131.5(s,C-9a),173.8(s,COOH),以上数据与文献[13]报道基本一致,鉴定化合物6为(1S,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物7白色粉末,易溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z231.113 3 [M + H]+(calcd for 231.113 4,C13H15O2N2),分子式为C13H14O2N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.48(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.32(1H,d,J=8.1 Hz,H-8),7.13(1H,m,H-7),7.04(1H,dd,J=11.0,3.9 Hz,H-6),4.89(1H,m,H-1),4.12(1H,dd,J=8.8,5.6 Hz,H-3),3.37(1H,dd,J= 16.4,5.6 Hz,H-4a),3.16(1H,dd,J=16.0,8.6 Hz,H-4b),1.71(3H,d,J=6.9 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:49.1(d,C-1),54.9(d,C-3),24.0(t,C-4),119.3(d,C-5),120.6(d,C-6),123.5(d,C-7),112.3(d,C-8),18.7(d,C-10),106.7(s,C-4a),127.6(s,C-4b),138.6(s,C-8a),131.6(s,C-9a),173.7(s,COOH)。结合文献[14]报道数据,故鉴定化合物7为(1R,3S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物8白色粉末,易溶于甲醇;(14.7(c0.36,MeOH),(-)-HR-ESI-MS:m/z164.072 0 [M-H]-(calcd for 164.071 2,C9H10O2N),分子式为C9H11O2N;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.31(5H,m,H-2,3,4,5,6),3.84(1H,dd,J=8.8,4.3 Hz,H-8),3.34(1H,m,H-7a),3.02(1H,dd,J=14.5,9.0 Hz,H-7b);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:137.4(s,C-1),130.6(d,C-2,C-6),130.1(d,C-3,C-5),128.6(d,C-4),38.4(t,C-7),57.7(d,C-8),173.9(s,COOH)。以上数据和文献[15]报道一致,故鉴定化合物8为L-phenylalanine。

化合物9白色粉末,易溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z138.091 9 [M + H]+(calcd for 138.091 9,C8H12ON),分子式为C8H11ON;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.77(2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5),3.11(2H,t,J=7.5 Hz,H-8),2.87(2H,t,J=8.2 Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:128.6(s,C-1),131.0(d,C-2,C-6),116.8(d,C-3,C-5),157.8(s,C-4),33.9(t,C-7),42.4(t,C-8)。以上数据与文献[16]报道基本一致,故鉴定化合物9为tyramine。

化合物10白色结晶,溶于甲醇;(-)-HR-ESI-MS:m/z159.093 0 [M-H]-(calcd for 159.092 2,C10H11N2),分子式为C10H12N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J=7.9 Hz,H-4),7.38(1H,d,J= 8.1 Hz,H-7),7.19(1H,s,H-2),7.12(1H,m,H-6),7.04(1H,m,H-5),3.23(2H,t,J=7.2 Hz,H-9),3.13(2H,t,J=7.3 Hz,H-8);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:124.5(d,C-2),110.4(d,C-3),119.0(d,C-4),120.1(d,C-5),122.8(d,C-6),112.7(d,C-7),24.6(t,C-8),41.9(t,C-9),128.3(s,C-3a),138.4(s,C-7a)。以上数据和文献[17]报道基本一致,故鉴定化合物10为tryptamine。

化合物12白色粉末,溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z175.087 0 [M + H]+(calcd for 175.087 1,C10H11ON2),分子式为C10H10ON2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.27(1H,s,H-2),8.23(1H,m,H-4),7.49(1H,dd,J=7.0,1.1 Hz,H-7),7.26(2H,tt,J=7.2,5.9 Hz,H-5,H-6),4.44(1H,s,H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:135.2(d,C-2),115.1(s,C-3),124.9(d,C-4),122.7(d,C-5),123.8(d,C-6),113.3(d,C-7),187.2(s,C-8),45.5(t,C-9),126.8(s,C-3a),138.5(s,C-7a)。以上数据与文献[18]报道基本一致,故鉴定化合物12为8-oxo-tryptamine。

化合物13白色粉末,溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z193.097 9 [M + H]+(calcd for 193.097 7,C10H13O2N2),分子式为C10H12O2N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.38(1H,dd,J=7.4,0.6 Hz,H-4),7.29(1H,td,J=7.7,1.2 Hz,H-6),7.09(1H,td,J=7.6,0.9 Hz,H-5),6.92(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),3.32(1H,m,H-8a),3.20(1H,m,H-8b),2.26(1H,dt,J=14.4,7.2 Hz,H-9a),2.03(1H,ddd,J=14.4,7.3,6.2 Hz,H-9b);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:181.6(s,C-2),76.1(s,C-3),125.0(d,C-4),124.2(d,C-5),133.0(d,C-6),111.7(d,C-7),35.9(t,C-8),36.6(t,C-9),131.2(d,C-3a),142.4(s,C-7a)。文献[19]报道该化合物在200-500 nm之间没有CD吸收峰,因此无法确定构型。以上数据和文献[19]报道基本一致,故鉴定化合物13为3-(2-aminoethyl)-3-hydroxyindolin-2-one。

化合物14白色粉末,溶于甲醇;(+)-HR-ESI-MS:m/z169.076 3 [M + H]+(calcd for 169.076 6,C11H9N2),分子式为C11H8N2;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.84(1H,s,H-1),8.31(1H,d,J=3.9 Hz,H-3),8.22(1H,d,J=7.9 Hz,H-5),8.18(1H,d,J=5.3 Hz,H-4),7.60(2H,d,J=3.7 Hz,H-7,8),7.30(1H,dt,J=8.0,4.0 Hz,H-6);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:133.3(s,C-1),137.4(d,C-3),116.6(d,C-4),123.1(d,C-5),121.3(d,C-6),130.4(d,C-7),113.1(d,C-8),131.3(s,C-4a),122.2(s,C-4b),143.3(s,C-8a),137.4(s,C-9a)。以上数据和文献[20]报道基本一致,故鉴定化合物14为β-carboline。

化合物1～14的结构见图2。

图2 化合物1～14的化学结构

3 结论

从仿刺参内脏中分离得到14个单体化合物,化合物1为新化合物,化合物1和2互为顺反异构体,同属硫酸酯化烯烃,化合物3和4为硫酸酯化烷烃。硫酸酯类化合物是海洋棘皮动物产生的重要次级代谢产物,目前,已有文献报道从海星、海参、海绵、海蛇尾、海胆等海洋动物中分离得到系列硫酸酯取代的烃类化合物,对硫酸酯化烃类分子的活性研究表明该类分子具有抗菌活性、抗真菌活性、细胞毒性和抑制基质金属蛋白酶2的作用[14]。化合物5是一种由乳酸和苯丙氨酸组成的二肽类化合物,是一种新型的“运动因子”,是人在运动期间产生的代谢产物,可以降低肥胖小鼠的体重和脂肪组织的含量[12]。化合物6～14为含氮化合物。该研究成果深化了仿刺参化学成分的认识,为深入开发仿刺参内脏保健及药用价值提供参考。