蝉蜕中甲壳素的提取工艺优化及其抗氧化活性和止血效果评价

雷雨洁,程菁菁,汤 成,孟 燕

湖北中医药大学药学院,武汉 430000

甲壳素又称壳多糖,它是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接的线性大分子生物多糖[1],半透明片状固体,由于多糖链间氢键相连,导致甲壳素不溶于水、稀酸、稀碱或一般有机溶剂。甲壳素广泛存在于海洋及陆地上的低等节肢动物、昆虫外壳及某些藻类、菌类的细胞壁中,其提取方法有酸碱法、酶水解法、EDTA法、微生物发酵法、离子液体法[2-5]等。甲壳素具有抗氧化、止血、抑菌[6]、抗肿瘤[7]、降血糖[8]、降血压、降血脂[9]、免疫调节[10]等生物活性,凭借其无毒、良好的生物相容性和生物降解性以及酶降解能力[11],被广泛应用于药物输送、组织工程、伤口愈合和癌症治疗等生物医学领域[12-14]。

蝉蜕(Periostracum Cicadae),为蝉科昆虫黑蚱羽化后的蜕壳,化学成分主要含有甲壳素、蛋白质、无机盐、氨基酸、微量元素等[15],其作为我国常用中药材,具有疏散风热、利咽、透疹、解痉、明目退翳的功效[16]。有研究表明,蝉蜕作为甲壳素的一种替代来源,其甲壳素具有较低的乙酰化度、结晶度、热性能以及其良好的生态安全性[17],但由于蝉蜕价格昂贵并且甲壳素品质没有固定的标准,目前关于蝉蜕甲壳素的研究进展缓慢。本研究通过超声辅助传统酸碱法提取蝉蜕中甲壳素,缩短了提取周期,并采用单因素和正交试验对提取工艺进行了优化,还对提取物的抗氧化活性和止血效果进行了测定,对推进蝉蜕甲壳素的相关研究、应用具有重要参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蝉蜕(批号:220601,湖北楚欣药业有限公司);盐酸(批号:20220524,国药集团化学试剂有限公司);氢氧化钠(批号:20150310,国药集团化学试剂有限公司);磷酸(批号:20201207,国药集团化学试剂有限公司);高锰酸钾(批号:20180504,国药集团化学试剂有限公司);亚硫酸氢钠(批号:20220110,国药集团化学试剂有限公司);DPPH自由基(批号:1898-66-4,国药集团化学试剂有限公司);过硫酸钾(批号:20221019,国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(批号:20221223,国药集团化学试剂有限公司);ABTS自由基(批号:30931-67-0,上海阿拉丁试剂有限公司);焦性没食子酸(批号:H2018158,上海阿拉丁试剂有限公司);牛血清白蛋白(批号:220220,上海如吉生物科技发展有限公司);考马斯亮蓝G-250(批号:HW20G1701-1,北京华威锐科化工有限公司);β-环糊精(批号:CQZ336,毕得医药);Tris-HCl(PH=8.2)缓冲溶液(批号:202304080,博尔森生物医药科技有限公司);云南白药(批号:ZAA2209,云南白药股份集团有限公司)。

冷冻干燥器(CTFD-10PT,青岛永合创信电子科技有限公司);马弗炉(SX-10-12,天津市泰斯特仪器有限公司);紫外可见分光光度计(UV-2550,岛津企业管理(中国)有限公司);色差仪(CR-410,日本柯尼卡美能达有限公司)。

1.2 动物

KM小鼠(SPF),体重25～30 g,雌性,辽宁长生生物技术股份有限公司,动物许可证号SYXK(鄂)2021-0089,获湖北中医药大学实验动物伦理委员会的批准(批准号HUCMS202205003)。

日本大耳白兔(SPF),体重2～3 kg,雌性,湖北逸挚诚生物科技有限公司,动物许可证号SCXK(鄂)2021-0020,获湖北省疾病预防控制中心实验动物管理与使用委员会的批准(批准号20232-40115)。

所有动物在适宜的环境中饲喂(自然采光,温度为22±2 ℃),适应一周后开始实验。

1.3 方法

1.3.1 药材预处理

将蝉蜕除泥沙,洗净,反复用水冲洗后烘干、磨碎、过筛。

1.3.2 单因素实验

1.3.2.1 盐酸脱除无机盐的单因素实验

用盐酸进行脱钙处理,分别以盐酸质量分数浓度、料液比、超声时间、超声功率为因素,以经盐酸处理后的蝉蜕干粉中灰分含量为指标进行单因素实验。盐酸质量分数分别采用3%、5%、8%、10%、12%,料液比分别采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,超声时间分别采用30、60、90、120、150 min,超声功率分别采用80 、120 、160 、200 、240 W,探讨盐酸质量分数浓度、料液比、超声时间、超声功率4个因素对盐酸脱除无机盐的影响。

采用干法灰化法测定灰分含量[18],按公式(1)计算灰分含量。

(1)

式中:M1、M2及M3分别为灼烧至恒重时的坩埚质量,坩埚与样品的总质量,坩埚与灰分的总质量。

1.3.2.2 氢氧化钠脱除蛋白质的单因素实验

根据文献报道中的方法制得脱钙之后的蝉蜕干粉。

用氢氧化钠溶液进行脱蛋白,分别以氢氧化钠质量分数浓度、料液比、超声时间、温度、超声功率为因素,以脱蛋白率为指标进行单因素实验。氢氧化钠质量分数分别采用4%、6%、8%、10%、12%,氢氧化钠溶液溶解时料液比分别采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,超声时间分别采用30、60、90、120、150 min,氢氧化钠溶液碱浸温度分别采用40、50、60、70、80 ℃,超声功率分别采用80、120、160、200、240 W,探讨氢氧化钠质量分数浓度、料液比、超声时间、温度、超声功率5个因素对氢氧化钠脱除蛋白质的影响。

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[19],按公式(2)粗略地评价脱蛋白率。

(2)

式中:P总为反复脱蛋白后滤液中蛋白含量,P为每组实验脱掉的总蛋白。

1.3.3 正交实验

1.3.3.1 盐酸脱除无机盐的正交实验设计

选择盐酸质量分数浓度、盐酸溶液溶解时料液比、超声时间、超声功率4个因素为考察对象,在单因素实验得到的最适值两端再各取1个水平,采用四因素三水平正交设计对工艺条件进行优化,因素及水平设置见表1。固定超声温度为25 ℃。实验重复3次。

表1 盐酸脱除无机盐因素水平

1.3.3.2 氢氧化钠脱除蛋白质的正交实验设计

通过单因素实验,不同超声功率下实验结果无显著性差异,选择氢氧化钠质量分数浓度、氢氧化钠溶液溶解时料液比、超声时间、氢氧化钠溶液碱浸温度4个因素为考察对象,在单因素实验得到的最适值两端再各取1个水平,采用四因素三水平正交设计对工艺条件进行优化,因素及水平设置见表2。固定超声功率为120 W。实验重复3次。

表2 氢氧化钠脱除蛋白质因素水平

1.3.3.3 高锰酸钾和亚硫酸氢钠脱色素的正交实验设计

选择高锰酸钾质量分数浓度、亚硫酸氢钠质量分数浓度、脱色时间、脱色温度4个因素为考察对象,根据文献报道中的最适3个因素,采用四因素三水平正交设计对工艺条件进行优化,因素及水平设置见表3。实验重复3次。

表3 高锰酸钾和亚硫酸氢钠脱色素因素水平

利用色差仪测定干燥后的样品的白度[20],按公式(3)计算样品白度(WH)。

(3)

1.3.4 蝉蜕甲壳素的抗氧化活性分析

根据文献报道的方法以甲壳素混悬液研究其抗氧化活性。蝉蜕甲壳素混悬剂的制备:将干燥的蝉蜕甲壳素置于烧杯中,量取适量的1%β-环糊精溶液,密封,40 ℃超声50 min。

1.3.4.1 ABTS自由基清除能力测定

将浓度为7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合,室温避光放置16～24 h,即储存液,用水稀释,制得在734 nm处吸光度为0.70±0.02的工作液备用。将提取物稀释成适宜浓度梯度的溶液,将1 mL待测样品溶液和9 mLABTS工作液混合,避光反应6 min,在734 nm波长下测定吸光度,每个样品和对照均重复测定3次[21]。按公式(4)计算ABTS自由基清除率。

(4)

式中:A0为样品的溶剂与ABTS工作液的混合溶液的吸光度;A1为ABTS工作液与不同浓度样品混合溶液的吸光度;A2为不同浓度样品和ABTS的溶剂的吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力测定

DPPH溶液的配制(现配现用):准确称取19.7 mg DPPH,用无水乙醇定容于250 mL容量瓶中,得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。将提取物稀释成适宜浓度梯度的溶液,将2 mL待测样品溶液和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液涡旋混合后,避光反应30 min,在517 nm波长下测定吸光度[22],每个样品和对照均重复测定3次。按公式(5)计算DPPH自由基清除率。

(5)

式中:A0为样品的溶剂与DPPH溶液的混合溶液的吸光度;A1为DPPH溶液与不同浓度样品混合溶液的吸光度;A2为不同浓度样品和DPPH的溶剂的吸光度。

(6)

式中:A1为不同浓度样品与混合溶液的吸光度;A2为样品的空白溶剂与混合溶液的吸光度;A0为邻苯三酚溶液的溶剂与混合溶液的吸光度。

1.3.5 蝉蜕甲壳素的体外和体内的止血活性分析

1.3.5.1 体外促凝血活性

用试管法测定甲壳素的体外促凝血活性。取洁净的试管,分别加入160、80、40、20、10 mg的甲壳素粉末,空白试管作阴性对照,80 mg云南白药粉末作阳性对照,每样品设三支试管。使粉末尽量铺开于试管底部,37 ℃水保温1 h,用肝素抗凝管自兔耳缘静脉取血开始计时,依次将1 mL新鲜抗凝兔血加入样品试管中,平稳地移至37 ℃水浴中,每隔30 s将第一支试管倾斜一次(角度小于30°),其余暂时不动,直至第一支试管缓慢倒置血液不流动为止,以同样方法观察其余管内的血全凝后,记下该组凝血时间。凝血时间以60 min为上限,超过即判为不凝血[24]。每样品重复试验3次。

1.3.5.2 体表止血活性

用断尾法测定甲壳素对体表创口的出血时间和出血量的影响。小鼠以1%戊巴比妥钠麻醉,给药容量为5 μL/g体重,待麻醉效果完全后,尾部擦拭碘伏消毒于小鼠尾尖0.5 cm处横向切断,血液自动流出第一滴后用滤纸吸去,将出血尾尖分别与10、20、40、80 mg甲壳素粉末与40 mg云南白药粉末充分接触,每隔30 s用预先称量好的滤纸吸去渗出血液,至出血完全停止作为出血时间。称量吸取血液的滤纸,减去原重记为出血量[25]。每样品重复3 只小鼠,40 mg云南白药粉末为阳性对照,对创口不作处理的为阴性对照。每样品重复试验3次。

1.3.5.3 体内止血活性

小鼠以1%戊巴比妥钠麻醉,给药浓度为5 μL/g体重,待麻醉效果完全后,用脱毛膏去除术区毛发并用碘伏消毒,随后用酒精进行脱碘处理。待小鼠完全处于麻醉状态后,仰卧固定,腹中部作约2 cm纵行切口,清理腹腔液,将滤纸垫置于充分显露的小鼠肝脏下,在肝中部快速用手术刀制造约1.0 cm×1.0 cm的渗血创口,待伤口出血时开始计时。敷上10、20、40、80 mg甲壳素粉末、40 mg淀粉粉末(阴性对照)及40 mg云南白药粉末(阳性对照),每隔30 s用滤纸片轻轻擦拭伤口处,直至其不再出血为止,记录停止出血的时间[26]。小鼠肝创口出血的时间即为小鼠从开始出血到停止出血的时间间隔。每样品重复试验3次。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 盐酸脱除无机盐的单因素实验

2.1.1.1 盐酸质量分数浓度的确定

不同质量分数浓度盐酸溶液处理后的灰分含量如图1所示,盐酸质量分数浓度为8%时,灰分含量低至2.46%。由单因素方差分析结果可知,盐酸质量分数浓度为8%、10%、12%与盐酸质量分数浓度为3%有显著差异。随着盐酸质量分数浓度的增加,灰分含量降低,无机盐的脱除效果显著。当盐酸质量分数浓度高于8%后,灰分含量减少相对较小并趋于平缓。选择盐酸质量分数浓度为8%、10%、12%三个水平进行正交实验。

图1 不同质量分数浓度盐酸溶液处理后的灰分含量

2.1.1.2 料液比的确定

盐酸溶液脱钙时不同料液比处理后的灰分含量如图2所示,当料液比为1∶25时,灰分含量低至2.00%。由单因素方差分析结果可知,料液比为1∶20、1∶25、1∶30与料液比为1∶10有显著差异。随着盐酸溶液溶解时料液比的增加,灰分含量降低,无机盐的脱除效果显著。当盐酸溶液溶解时料液比高于1∶20后,灰分含量减少相对较小并趋于平缓。选择料液比为1∶20、1∶25、1∶30三个水平进行正交实验。

图2 盐酸溶液溶解时不同料液比处理后的灰分含量

2.1.1.3 超声时间的确定

盐酸溶液脱钙时不同超声时间处理后的灰分含量如图3所示,当超时时间为150 min时,灰分含量低至1.50%。由单因素方差分析结果可知,超声时间为150 min与超声时间为30 min有显著差异(P<0.05)。随着超声时间的增加,灰分含量降低,无机盐的脱除效果显著。当超声时间大于120 min后,灰分含量减少相对较小并趋于平缓。选择超声时间90、120、150 min三个水平进行正交实验。

图3 不同超声时间处理后的灰分含量

2.1.1.4 超声功率的确定

盐酸溶液脱钙时不同超声功率处理后的灰分含量如图4所示,当超时功率为120 W时,灰分含量低至1.69%。由单因素方差分析结果可知,超声功率为120、160、200、240 W与超声功率为80 W均有显著差异。随着超声功率的增加,灰分含量降低,无机盐的脱除效果显著。当超声功率高于120 W后,灰分含量减少相对较小并趋于平缓。选择超声功率为120、160、200 W三个水平进行正交实验。

图4 不同超声功率处理后的灰分含量

2.1.2 氢氧化钠脱除蛋白质的单因素实验

2.1.2.1 氢氧化钠质量分数浓度的确定

不同质量分数浓度氢氧化钠溶液的脱蛋白率如图5所示,当氢氧化钠质量分数浓度为6%、8%、10%、12%时,脱蛋白率都高达95%以上。随着氢氧化钠质量分数浓度的增加,脱蛋白率升高,但碱浓度越大,更易造成脱乙酰化。选择氢氧化钠质量分数浓度为6%、8%、10%三个水平进行正交实验。

图5 不同质量分数浓度氢氧化钠溶液处理的脱蛋白率

2.1.2.2 氢氧化钠溶液溶解时料液比的确定

氢氧化钠溶液脱蛋白时不同料液比处理后的脱蛋白率如图6所示,当料液比为1∶20、1∶25、1∶30时,脱蛋白率都高达95%以上。随着料液比的增加,脱蛋白的效果也越显著。当料液比高于1∶20后,脱蛋白率的增大趋于平缓。选择料液比为1∶20、1∶25、1∶30三个水平进行正交实验。

图6 氢氧化钠溶液溶解时不同料液比处理的脱蛋白率

2.1.2.3 超声时间的确定

氢氧化钠溶液脱蛋白时不同超声时间处理后的脱蛋白率如图7所示,当超声时间为60、90、120、150 min时,脱蛋白率都高达95%以上。当超声时间大于60 min后,脱蛋白率的增大趋于平缓。选择料液比为60、90、120 min三个水平进行正交实验。

2.1.2.4 氢氧化钠溶液碱浸温度的确定

氢氧化钠溶液脱蛋白时不同碱浸温度处理后的脱蛋白率如图8所示,当碱浸温度为60、70、80 ℃时,脱蛋白率都高达95%以上。由单因素方差分析结果可知,碱浸温度为60、70、80 ℃与碱浸温度为40 ℃有显著差异。选择碱浸温度为60、70、80 ℃三个水平进行正交实验。

2.1.2.5 超声功率的确定

氢氧化钠溶液脱蛋白时不同超声功率处理后的脱蛋白率如图9所示,由单因素方差分析结果可知,各组组间都无显著差异。

图9 不同超声功率处理的脱蛋白率

2.2 正交实验

2.2.1 盐酸脱除无机盐的正交实验

由表4可知,四种影响蝉蜕脱无机盐效果的因素顺序为:C、D、B、A,超声时间对脱除无机盐效果影响最大,超声功率次之,盐酸质量分数浓度影响最小。通过对正交实验结果的分析,可以得出最优脱钙条件是A1B2C3D2,即:HCl质量分数浓度为8%、固液比为1∶25、超声时间为150 min、超声功率为160 W。

表4 盐酸脱除无机盐的正交实验方案与结果

2.2.2 氢氧化钠脱除蛋白质的正交实验

由表5可知,四种影响蝉蜕脱蛋白效果的因素顺序为:C、A、D、B,超声时间对脱除蛋白效果影响最大,氢氧化钠质量分数浓度次之,料液比影响最小。

表5 氢氧化钠脱除蛋白质的正交实验方案与结果

通过对正交实验结果的分析,可以得出最优脱钙条件是A3B2C2D1,即:NaOH质量分数浓度为10%、固液比为1∶25、超声时间为90 min、碱浸温度为60 ℃。

2.2.3 高锰酸钾和亚硫酸氢钠脱色素的正交实验

由表6可知,四种影响脱色素效果的因素顺序为:A、C、D、B,高锰酸钾质量分数浓度对脱除色素效果影响最大,脱色时间次之,亚硫酸氢钠质量分数浓度影响最小。通过对正交实验结果的分析,可以得出最优脱钙条件是A3B2C1D2,即:KMnO4质量分数浓度为5%、NaHSO3质量分数浓度为8%、脱色时间组合为60+90 min、脱色温度为90 ℃。

表6 高锰酸钾和亚硫酸氢钠脱色素的正交实验方案与结果

2.3 蝉蜕甲壳素的抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力

当蝉蜕甲壳素混悬液浓度为18 mg/mL时,ABTS自由基的清除率为91.31%(见图10),表现出较强的自由基清除能力。

图10 蝉蜕甲壳素对ABTS自由基清除能力

2.3.2 DPPH自由基清除能力

当蝉蜕甲壳素混悬液浓度为15 mg/mL时,DPPH自由基的清除率为35.19%(见图11)。

图11 蝉蜕甲壳素对DPPH自由基清除能力

图12 蝉蜕甲壳素对自由基清除能力

2.4 蝉蜕甲壳素的体外和体内的止血活性

2.4.1 体外促凝血活性

如图13所示,不同剂量的蝉蜕甲壳素粉末均有一定的体外促凝血能力,且其活性随剂量的增大而升高,样品的促凝血活性呈现一定的剂量相关性,而空白组的抗凝兔血在60 min内完全不凝,与空白对照组相比,40、80、160 mg蝉蜕甲壳素的凝血时间极显著地缩短,同时,与阳性对照组相比,80、160 mg蝉蜕甲壳素的凝血时间极显著地缩短。甲壳素体外促凝血能力优于云南白药粉末。

图13 兔血凝固时间

2.4.2 体表止血活性

如图14、15所示:在小鼠断尾实验中,各剂量的蝉蜕甲壳素粉末及云南白药粉末阳性对照与空白对照组相比均可显著缩短出血时间,且样品的止血活性呈现一定的剂量相关性。10、20、40、80 mg蝉蜕甲壳素可以将鼠尾出血时间缩短31.7%、70.2%、81.5%和83.8%,40 mg云南白药阳性对照可将鼠尾的出血时间缩短49.7%;10、20、40、80 mg蝉蜕甲壳素可以将鼠尾出血量降低35.7%、35.7%、49.0%和56.1%,40 mg云南白药阳性对照可将鼠尾出血量降低41.8%。同时,相同剂量的蝉蜕甲壳素粉末与云南白药粉末相比,蝉蜕甲壳素的出血时间以及出血量都有显著差异,说明蝉蜕甲壳素止血能力优于云南白药粉末。

图14 鼠尾出血时间

图15 鼠尾出血量

2.4.3 体内止血活性

如图16所示:蝉蜕甲壳素可显著缩短肝创口的出血时间,10、20、40、80 mg蝉蜕甲壳素对肝创口的出血时间分别缩短37.4%、42.9%、70.2%和77.2%,40 mg云南白药阳性对照可将肝创口的出血时间缩短49.6%,相同剂量的蝉蜕甲壳素数据更优于云南白药阳性对照,说明蝉蜕甲壳素对体内含血量较丰富的脏器的出血性创口有较好的止血作用。

图16 肝脏出血时间

3 讨论与结论

通过单因素试验结合正交试验得到超声辅助酸碱提取蝉蜕中甲壳素的最佳工艺参数为:脱钙:质量分数:8%盐酸,温度:室温,料液比:1∶25,超声功率:160 W,超声时间:150 min;脱蛋白:质量分数:10%氢氧化钠,温度:60 ℃,料液比:1∶25,超声功率:无显著差异,超声时间:90 min;脱色:质量分数:5%高锰酸钾、8%亚硫酸氢钠,温度:90 ℃,时间:高锰酸钾反应60 min、亚硫酸氢钠反应90 min。脱钙和脱蛋白时以超声辅助,增加溶剂的穿透力,有效地缩短了提取时间。

试管法测定不同剂量甲壳素粉末对兔血体外凝血时间结果表明:蝉蜕甲壳素粉末的体外促凝血能力随蝉蜕甲壳素剂量的增大而增强,相同剂量的蝉蜕甲壳素粉末与云南白药粉末相比,蝉蜕甲壳素体外促凝血能力显著优于云南白药粉末。断尾法测定不同剂量蝉蜕甲壳素粉末对小鼠断尾出血时间和出血量结果表明:各剂量的蝉蜕甲壳素粉末及云南白药粉末阳性对照与空白对照组相比均可显著缩短出血时间,相同剂量的蝉蜕甲壳素粉末与云南白药粉末相比,甲壳素的出血时间以及出血量都有显著差异,说明蝉蜕甲壳素止血能力优于云南白药。建立小鼠肝脏出血模型,测定创口出血时间,结果表明:蝉蜕甲壳素可显著缩短肝创口的出血时间,且相同剂量的蝉蜕甲壳素数据更优于云南白药阳性对照,蝉蜕甲壳素对体内含血量较丰富的脏器如肝脏的出血创口有较好的促进血液凝固的作用,具有开发成手术切除部分脏器后创口止血材料的潜力。