内镜医师快速现场评估在行免疫组织化学染色的胰腺实性病变诊断中的应用

熊定堃 刘泳汝 冯云路 赵雨 吴晰 郭涛 蒋青伟 王强 伍东升 张晟瑜杨莹韵 杨爱明

1中国医学科学院北京协和医院消化内科，北京 100730；2中国医学科学院北京协和医院病理科，北京 100730

作为消化内镜诊疗常规的一部分，内镜超声引导下组织取样（endoscopic ultrasound-guided tissue acquisition, EUS-TA）在胰腺实性病变中的价值越来越受到重视，目前已是公认安全、可靠的获取诊断标本的重要手段[1]。根据使用的穿刺针型可将EUS-TA进一步分类为细针穿刺抽吸（fine-needle aspiration,FNA）和细针穿刺活检（fine-needle biopsy, FNB）。相比FNB针，FNA针在获取组织学评估所需的核心组织方面能力较弱，尤其是在缺乏快速现场评估（rapid on-site evaluation, ROSE）的情况下更是如此[2]。由细胞病理学医师进行的ROSE可为内镜医师提供实时反馈，从而提高EUS-FNA标本的充分性和准确性[3]。然而由于ROSE依赖于病理医师在场，其实际应用受到了限制[4-5]。目前已有经验表明，经过培训的内镜医师可以像细胞病理学医师一样准确地完成ROSE[3-4]。此外，使用具备斜面、切割、核心活检等设计的FNB针进行EUS-TA可获取更充足的标本，并减少针穿次数[5]。虽然内镜医师可以通过肉眼即宏观现场评估（macroscopic on-site evaluation, MOSE）[6]来判定EUS-FNB是否获取了核心组织条，但无法同ROSE一样区分正常组织和病变组织。并且既往评价ROSE对于EUS-TA准确性影响的研究中，大部分病例为恶性肿瘤患者，意味着ROSE涂片中可以见到明显的异型细胞从而明确诊断[3]。而对于其他胰腺实性病变如胰腺神经内分泌肿瘤（pancreatic neuroendocrine tumor, PNET）、胰腺实性假乳头状瘤（solid pseudopapillary tumor, SPT）、淋巴瘤及间叶源性肿瘤（包括平滑肌肉瘤、Ewing肉瘤）等，往往需要进行细胞学或组织病理的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）染色以明确诊断。目前对于ROSE在此类疾病中是否真正提高了EUS-TA的准确性尚无明确结论。因此，本项单中心、观察性的回顾性研究比较了在依赖IHC染色明确诊断的胰腺实性病变中进行有或无由内镜医师完成ROSE的不同类型EUS-TA的诊断效果。

资料与方法

一、一般资料

回顾性收集2018年8月至2022年10月间北京协和医院内镜中心1 573例行EUS-TA患者的临床资料。纳入标准：（1）经腹部超声、CT、PET-CT或MRI证实为实性胰腺肿块；（2）EUS-TA成功取得细胞学和（或）组织学标本；（3）6～12个月随访期间临床或病理诊断明确为PNET、SPT、淋巴瘤及间叶源性肿瘤。排除标准：（1）无实性成分的胰腺囊性病变或假性囊肿者；（2）无明确临床诊断或失访者。最终纳入65例。根据EUS-TA后内镜医师进行或未进行ROSE，将患者分为ROSE组（36例）和非ROSE组（29例）；根据EUS-TA使用的针型，进一步分为FNA-ROSE组（26例）、FNB-ROSE组（10例）、FNA-非ROSE组（24例）、FNB-非ROSE组（5例）。

二、EUS引导下组织取样

EUS由7名经验丰富的内镜医师完成。采用线性阵列回声内镜（GF-UCT260或GF-UCT240配备EU-ME2 Premier，日本Olympus公司）进行。EUS-TA选择使用FNA或FNB以及具体的针型由内镜医师根据其经验和对病灶的综合评估（包括病灶大小、病灶位置及与周围血管的关系）决定。FNA使用19G、22G、25G FNA针（Cook EchoTip Ultra®或Boston Scientific ExpectTM），FNB使用20G、22G FNB针（Cook EchoTip ProCore®或Boston Scientific AcquireTM）。

具体操作步骤：将内镜经口腔插入并推进到胃或十二指肠，在识别和定位胰腺病灶后，应用彩色多普勒以避开主要血管并确保安全，找到最佳穿刺路径，然后经胃或经十二指肠（或两者）进行穿刺活检。取样方法包括干抽法、湿抽法，带或不带负压[7]，穿刺针在病灶内前后移动15～20次以取得更多标本。将获得的组织碎片均匀涂在若干张载玻片上，采用乙醇固定，将组织条固定于10%甲醛溶液中，其余样本用于液基细胞学检查。内镜医师根据获取的样本量酌情决定是否进行重复穿刺。所有样本最后均送至病理科，由经验丰富的病理医师进一步行细胞学或组织病理学评估，必要时行IHC染色和分子生物学检测以明确诊断。

三、ROSE操作步骤

7名内镜医师均已独立完成100例以上EUS-TA操作，或在过去12个月内至少完成50例，且均已完成ROSE培训并获得独立阅片资格。培训内容包括涂片的制片和染色技术，及ROSE阅片步骤和EUSTA涂片常见的慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺导管腺癌、PNET、SPT、转移癌等胰腺细胞病理学特征。培训持续3个月，直到内镜医师能够熟练地独立完成标准的ROSE并通过病理医师的考核。

在EUS-TA成功穿刺病灶后，内镜医师及助手将1张或多张取样涂片风干，采用Diff-Quik染色法进行ROSE染色，随后在床旁的光学显微镜下检查是否存在异常细胞，同时评估穿刺取样是否满意或是否需要继续穿刺取样。在EUS-TA操作结束后，ROSE涂片与其他活检标本一同送至病理科，由病理医师进一步行细胞病理学诊断。

四、IHC染色

病理医师对包含ROSE涂片的所有活检标本完成评估，根据细胞病理学、组织病理学表现进一步进行IHC染色明确诊断。对疑似自身免疫性胰腺炎的切片用IgG4、CD38和CD138染色；疑似PNET的切片用CgA、Syn和CD56染色；疑似间质瘤的切片用c-kit、CD34、DOG-1、α-SMA、Desmin和S-100染色；疑似淋巴瘤的切片用CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD45RO、CD79a、PAX5和BCL2染色。

五、观察指标

记录患者的性别、年龄；EUS-TA前实验室检查结果包括胆红素、CA19-9水平；影像学检查结果包括病灶部位、病灶大小；EUS-TA数据包括病灶大小、穿刺针类型、针径、穿刺点位置和穿刺针道数）；病理学常规及ROSE涂片、液基细胞学、组织病理学；随访结局。

六、统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验或Mann-WhitneyU检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。使用二项logistic多因素回归分析ROSE及穿刺类型对诊断准确性和IHC成功率的影响。诊断准确率的计算方法为比较EUS-TA的细胞学或组织病理学诊断与最终诊断（包括病理诊断、随访及治疗结局）之间的一致性。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组患者临床特征比较

65例患者中，46例（70.8%）为PNET，13例为SPT，6例为淋巴瘤及间叶源性肿瘤。病变多位于胰头、胰颈和钩突部（47/65，72.3%）。21.5%（14/65）的患者接受了手术治疗并确诊，其余患者均通过EUS-TA明确病理诊断或经过治疗与随访达到临床诊断。各组患者性别、年龄、直接胆红素、总胆红素、CA19-9及CT或MRI下病灶部位、病灶大小等临床特征差异均无统计学意义，具有可比性（表1）。ROSE组和非ROSE组，FNA-ROSE组和FNA-非ROSE组、FNB-ROSE组和FNB-非ROSE组患者的EUS病灶平均大小以及穿刺针径、穿刺点位置、穿刺针道数的差异亦均无统计学意义（表1）。

表1 不同类型内镜超声引导下组织取样及快速现场评估分组患者的临床特征

二、应用ROSE对诊断准确率和IHC成功率的影响

与非ROSE组比较，ROSE组有更高的诊断准确率（88.9%比79.3%），差异有统计学意义（P=0.023），但两组的IHC成功率差异无统计学意义（P＞0.100）。在FNA-ROSE组和FNA-非ROSE组、FNB-ROSE组和FNB-非ROSE组之间进行亚组分析，未观察到应用ROSE对于诊断准确性和IHC成功率存在显著影响。FNA-ROSE组较FNA-非ROSE组表现出更高的诊断准确率（88.5%比75.0%），但差异无统计学意义（P＞0.100）。FNB-ROSE组和FNB-非ROSE组间诊断准确率及IHC成功率差异亦无统计学意义（表2）。

表2 不同类型内镜超声引导下组织取样及快速现场评估的诊断准确率及免疫组织化学成功率（%）

进一步采用二项logistic回归将是否行ROSE、使用的针型（FNA或FNB）、最终诊断纳入多因素分析，没有发现影响诊断准确率的独立因素（表3）。

表3 影响诊断准确性的二项logistic多因素回归分析

讨 论

笔者所在的内镜中心是国内最大的内镜中心之一，率先开展了内镜医师实施ROSE的EUS-TA操作。本研究回溯了超过5年的病例资料，并聚焦于依赖病理切片IHC染色鉴别诊断的罕见病变，比较了ROSE在不同EUS-TA类型中的诊断准确率，旨在评估ROSE在此类疾病诊断中的有效性。

本研究结果表明，内镜医师完成的ROSE可以提高EUS-TA的诊断准确性。但由于本研究涉及的疾病种类的罕见性及细胞病理学特征，纳入的病例中不存在假阴性及假阳性结果，因此未计算分析灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标。既往的研究显示，ROSE可将EUS-TA的诊断能力提高约15%[8-9]，本研究表明ROSE可将EUS-TA的诊断准确率提高至接近90%。

理论上，ROSE是提高EUS-FNA诊断胰腺实性肿块准确性和敏感性的理想辅助方法，不仅可以优化穿刺策略，实时评估样本质量和数量，而且可以在操作同时作出初步的诊断，能最大限度地减少穿刺针道数，减少重复取样，因此被欧洲消化内镜学会（European Society of Gastrointestinal Endoscopy，

ESGE）推荐使用[10]。然而，由于需要病理医师的协助，ROSE的推广在医疗资源紧缺的国家和地区受到了限制。基于此，笔者所在中心通过由内镜医师开展ROSE为这一问题提出了解决方案。结果显示，EUS-TA同时行ROSE使依赖IHC染色明确诊断的胰腺实性病变的诊断准确率提高了9.6%。类似地，Zhang等[3]的研究证实了内镜医师的ROSE与病理医师对标本进行细胞病理学评估的结果高度一致，并且内镜医师的ROSE提高了24.7%的准确率。与既往研究中观察到ROSE能减少穿刺针道数不同，本研究显示ROSE组与非ROSE组的穿刺针道数差异无统计学意义，由于回顾例数较少，这一结果值得进一步观察验证。在既往的研究中，绝大多数病例的诊断为恶性肿瘤，病变在ROSE涂片中可见明显的异型细胞。本研究所涉及依赖IHC染色进行诊断的胰腺实性病变在ROSE的Diff-Quick染色下的表现特征为（1）PNET，肿瘤细胞呈带状或小梁状排列，细胞有丰富的颗粒状胞质和大小一致的圆形或卵圆形核；（2）SPT，肿瘤细胞呈分支乳头状排列，大小一致的细胞组成微腺泡结构，腺腔状结构内可见玻璃样小体；（3）淋巴瘤，散在分布单一类型的淋巴细胞，可见双核细胞；（4）间叶源性肿瘤，细胞大小一致，核卵圆形或梭形。因此，目前已有的研究是否能够反映ROSE在PNET等疾病中的价值仍存在疑问。本研究发现ROSE对于提高EUS-TA对该类疾病的诊断准确性具有潜在价值，并且这种作用可能不受FNA或FNB针型的影响。但由于疾病的罕见以及本研究内镜医师的ROSE开展时间较短，可纳入的样本量受限，最终结果仍需更大样本量的多中心前瞻性研究验证。

目前已有较多研究表明，对于依赖IHC染色进行诊断的胰腺实性病变，EUS-FNB相较EUS-FNA具有更高的诊断准确率和IHC成功率[11-13]。但本研究中未能观察到这样的差异，可能由于使用FNB针型的病例数明显少于FNA针型，存在样本的选择偏倚，也一定程度上解释了在总体和亚组分析时ROSE对诊断准确率影响作用的不一致。尽管存在样本量和针型的限制，本研究率先比较了EUS-TA在有无内镜医师实施ROSE情况下诊断PNET等需要IHC染色鉴别的胰腺实性病变的准确性，初步提示了ROSE在此类疾病诊断中的临床应用价值，后续可通过前瞻性多中心临床研究进一步验证。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明熊定堃：数据统计分析，文章撰写；刘泳汝：数据整理、论文审阅；冯云路：研究设计、研究指导、论文审阅；赵雨：研究指导、病理阅片、ROSE培训；吴晰、郭涛、蒋青伟、王强、伍东升、张晟瑜、杨莹韵：研究开展，数据收集；杨爱明：研究设计、研究指导、经费支持