基于网络药理学及分子对接方法探析厚朴三物汤治疗便秘的机制研究

康蕾，梁磊，洪关婷，王一琼，莘莉琼，杨勇军

川北医学院附属医院 中西医结合肛肠科，四川 南充 637000

便秘是常见的胃肠道疾病，主要临床表现为大便干燥、排便时间延长、排便次数减少[1]，在中医学属“便秘”范畴。当今社会，随着社会人口老龄化、生活习惯改变、生活压力增大等各类因素，便秘发生率呈逐年上升的趋势。研究表明，便秘对多种疾病的发生也有直接影响，如帕金森病、多种肛周疾病、乳腺疾病、冠心病等。西医对便秘的治疗主要以各类泻剂为主，但疗效欠佳，所以结合现代分子生物学及生物信息学探索更多中药治疗便秘的有效途径是必要的。

《金匮要略》中首次记载厚朴三物汤，述其由大黄、枳实、厚朴3 味药组成，厚朴为君，主气，大黄为臣主泻，枳实为佐药主滞。该方立于“通”重在“行气”，具有行气导滞通便之功[2]。其方中重用厚朴，极大加强了该方行气的功效。尤善治疗实热内积，气滞不行，气滞重于实积之便秘。根据现有研究表明，其方中含有芦荟大黄素、厚朴酚等成分，具有明显的肌松弛、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌作用[3]，可增强胃肠蠕动、改善便秘。

网络药理学是通过各数据库、运用网络技术构建“药物成分–靶点–信号通路–疾病”相互作用关系的方法，在对分析各类药物作用发生机制的过程中有着重要意义。分子对接是一种用于药物研究的方法，能够识别具有治疗意义的新化合物，并在分子水平上预测配体–靶点相互作用关系[4]。本研究采用网络药理学和分子对接技术，筛选及分析厚朴三物汤治疗便秘的有效成分及作用靶点，为临床基础研究以及中药新药的研发提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 厚朴三物汤有效化合物成分及相关靶点筛选

利用中药系统药理学数据库（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为筛选条件，检索并获得厚朴三物汤中大黄、枳实、厚朴3 味中药的有效化合物及对应的靶点，筛选后在Uiprot 蛋白质数据库（https://www.uniprot.org）中将化合物作用的蛋白质靶点转化成规范的基因标识符。

1.2 便秘相关靶点筛选

以“constipation”为检索词，在 OMIM、GeneCards、PharmGKB、TTD、DrugBank 数据库中查找有关便秘的相关靶点，在各数据库获取的数据再通过R 语言的“Venn”软件包，去重后取交集并绘制韦恩图。

1.3 厚朴三物汤成分与靶点的网络构建与分析

将筛选的厚朴三物汤的有效成分及疾病关键靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建厚朴三物汤有效成分与靶点的可视化图，运用插CytoNCAA 分析视图的特征，设置节点值和自由度参数，以方便准确的观察复方中主要有效成分。将1.2 项下获得的便秘靶点导入String 数据库，选择物种为“人”模式，蛋白属设为“home sapiens”，highest confidence＝0.95，其他参数不变，获取蛋白质相互作用（PPI）网络图。利用CytoNCA 进行拓扑分析，筛选其核心靶点。

1.4 关键靶点的基因本体（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

利用生物信息软件包“ org.Hs.eg.db ”“enrichplot”“clusterProfiler”等数据包对厚朴三物汤有效成分和关键靶点进行GO 功富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 为阈值。以对GO 生物学过程中的生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）富集最高的前10 条绘制成条形图。将KEGG 通路富集程度最高的前20 条绘制成高级气泡图。

1.5 分子对接验证

在Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找关键靶点的2D 结构，再通过ChemOffice 软件进行转化成3D 结构。在Uniprot 数据库中检索疾病关键靶点基因，找到对应蛋白ID，在PDB（http://www.rcsb.org/）中下载关键靶点蛋白受体的3D 结构，再利用Pymol、AutoDockTools 软件进行对其进行去除水分子、原有配体和受体及分子的处理，进行加氢的处理后确定活性口袋。再运行Vina 对分子与靶点的最低结合能进行分析验证，最后利用Pymol 软件转化成可视化图。

2 结果

2.1 厚朴三物汤有效活性成分及对应靶点

通过TCMSP 数据库，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，获得厚朴三物汤有效活性成分，符合筛选条件的有效成分共39 个，其中大黄16 个，厚朴2 个，枳实21 个，见表1。活性成分对应靶点139 个。

表1 厚朴三物汤有效成分Table 1 Effective components of Houpu Sanwu Decoction

2.2 厚朴三物汤治疗便秘的潜在靶点

从在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 5 个数据库中，获取便秘的靶点分别为5 298、361、357、11、84 个，去掉重复化合物后后取并集，还剩余1 585 个，见图1。将厚朴三物汤主要有效成分的作用靶点与疾病的靶点数据取交集，最终获得厚朴三物汤作用于便秘的潜在靶点对应57 个，有效成分26 个，以韦恩图的形式展现交集靶点，见图2。

图1 便秘相关靶点Fig.1 Targets associated with constipation

图2 厚朴三物汤治疗便秘作用靶点Fig.2 Target of Houpu Sanwu Decoction in treatment of constipation

2.3 成分–靶点网络分析

在Cytoscape 数据库中，将26 个与便秘相关的有效成分、57 条相关基因导入构建活性成分–靶点网络图，见图3。可见同一个疾病靶点可与不同的活性成分相对应，不同的靶点也可对应相同的活性成分，厚朴三物治疗便秘具有多个靶点、多种成分特点。

图3 活性成分–靶点图Fig.3 Active ingredients–target plot

2.4 PPI 网络的构建分析与核心靶点筛选

将厚朴三物汤主要有效成分作用靶点与便秘疾病靶点取交集所获得的57 个靶点导入数String据库，选择最低互助评分为0.9，去除游离点，得到55 个节点和1 334 条边，见图4。将String 数据库中得到的PPI 网络文件导入Cytoscape 软件，利用CytoNCA 进行筛选及可视化处理，如图5 所示，其连接点数目较高的靶点基因有白细胞介素（IL）-1B、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、细胞周期素D1（CCND1）、肿瘤蛋白P53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶体增殖物激活受体G（PPARG）、表皮生长因子受体（EGFR）、胞间黏附分子-1（ICAM1）、MAPK14、原癌基因（MYC）、血红素加氧酶1（HMOX1）、雌激素受体1（ESR1）、前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2）、MAPK8、蛋白激酶B1（Akt1）、MAPK1、基质金属蛋白酶9（MMP9）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2），这些靶点是厚朴三物汤治疗便秘的关键靶点。

图4 厚朴三物汤蛋白PPI 网络图Fig.4 Protein PPI network of Houpo Sanwu Decoction

图5 核心靶点基因网络图Fig.5 Core target gene network

2.5 关键靶点的GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

将20 个关键靶点导入利用DAVID 数据库进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 为阈值筛选，得出BP 包含对营养素水平的反应、对金属离子的反应、对氧气水平的反应、对紫外线的反应、对药物的反应等2 008 条，CC 包含隔膜筏、膜微区、膜区、囊泡腔、核封装等67 个，MF 主要涉及磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合蛋白、核受体活动、配体激活的转录因子活性、DNA 结合转录因子、泛素蛋白连接酶结合等123 条。分别取富集最显著的前10 条经行可视化分析，见图6。对KEGG 通路进行筛选，以P＜0.05 为筛选条件，得到153 条信号通路，厚朴三物汤治疗便秘涉及的主要有内分泌抗药性、人巨细胞病毒感染、膀胱癌、直肠癌、卡波西肉瘤、疱疹病毒感染、IL-17、丙型肝炎、小细胞肺癌等信号通路。根据靶点数目及P值取前富集显著的前30 条进行可视化，见图7。

图7 KEGG 富集分析图Fig.7 KEGG enrichment analysis

2.6 分子对接

将自由度较高的的活性成分芦荟大黄素、木犀草素、柚皮素与2.4 项下筛选的核心基因IL-1B、VEGFA、MAPK3 进行分子对接，并利用pymol 软件进行可视化分析，见图8、表2。结果显示，芦荟大黄素与各核心靶点基因有较好的结合活性，提示芦荟大黄素与上述靶点相互作用较大可能为厚朴三物汤治疗便秘的重要机制，值得做进一步的实验验证。

图8 分子对接模式图Fig.8 Molecular docking model diagram

表2 厚朴三物汤治疗便秘核心有效成分与靶点结合能Table 2 Houpu Sanwu Decoction for treating constipation core active ingredient and target binding energy

3 讨论

厚朴三物汤为治疗便秘的有效方，具有通便泻热，消滞除满功效。中医认为便秘不仅与自身体质有关，还与环境、饮食等外在因素有关。气血亏虚虚、脾肾阳虚、阴血亏虚等为便秘的常见病机，其病位在大肠，且涉及肺、脾、肾等脏腑[5]。据历代医家总结及现代临床实践表明，厚朴三物汤主要对气滞型便秘疗效显著，但治疗机制至多为尚未清楚。故本研究通过各中药数据库，对药物的有效成分、疾病的靶点经行查找分析，以发现成分于靶点相互关系，为厚朴三物汤治疗便秘使用提供理论依据。

本研究通过网络筛选，得到厚朴三物汤的有57个活性成分，其中关键成分为芦荟大黄素、木犀草素、柚皮素。研究发现，芦荟大黄素可能是通过增加肌间的神经丛P 物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）的含量，以进一步增强肠道动力来缓解便秘[6]；Zheng 等[7]报道，芦荟大黄素也可以通过上调便秘小鼠肠组织中水通道蛋白3（AQP3）表达来改善胃肠蠕动而促进排便。木犀草素属天然黄酮类化合物，经研究其可以通过L 型钙离子通道来调节肠道平滑肌运动，也能够通过降低平滑肌细胞的Akt 磷酸化水平，抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 通路激活，起到抑制平滑肌增殖的作用以达到治疗便秘的作用[8]。柚皮素可调节血清中胃肠代谢相关成分的产生。研究显示柚皮素缓便秘症状的机制可能与上调lop 诱导便秘小鼠的Cajal 间质细胞和AQP3的表达增加相关[9]。因此芦荟大黄素、木犀草素、柚皮素极大可能为治疗便秘的关键有效成分，为临床新药的研发提供了理论基础。

PPI 网络显示，厚朴三物汤中有效化合物成分可能是通过IL-1B、VEGFA、MAPK3 等关键靶点起作用，IL-1B 可以显著增加肠上皮细胞中抗菌肽的表达，降低肠道炎症致病菌的存活率，减轻炎症对肠道环境的干扰[10]。MAPK3 是MAPK 家族成员。在便秘模型大鼠结肠组织中，通过阻断MAPK信号通路，可以下调APQ3、APQ4 的表达，有效减少肠道对水分重新吸收，减少便秘的发生[11]。

VEGFA 可促进新生血管形成，厚朴三物汤中的有效成分可能通过调节VEGFA 水平，以改善肠神经营养支持，促进肠道蠕动，以进一步缓解便秘。通过KEGG 富集分析可知，以上关键靶点作用于便秘有多条通路途径，主要包括内分泌抗药性、人巨细胞病毒感染、膀胱癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、IL-17、丙型肝炎、小细胞肺癌等信号通路。进一步说明厚朴三物汤治疗便秘很可能是通过免疫抑制、抗炎作用、抗病毒、抗肿瘤等多种方式发挥作用。通过分子对接将厚朴三物汤有效成分与关键靶点进行对接，结果显示二者能稳定结合，进一步说明厚朴三物汤有效成分能在体内稳定的发挥治疗作用。本研究表明，厚朴三物汤治疗便秘具有多成分、多靶点、多通路的特点。

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