基于TM2D1介导铁死亡探讨丙泊酚抑制结直肠癌的分子机制

路 艳, 朴宗方, 谭新敏, 苏 锐

(承德医学院附属医院本部麻醉科, 河北 承德 067000)

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种常见的胃肠道恶性肿瘤,具有高发病率和高死亡率的特点。结直肠癌的早期症状可能不明显,但随着肿瘤的进展,出现便血、腹泻、排便习惯改变、局部腹痛、贫血等症状,严重影响患者的健康和生活质量[1]。为提高结直肠癌的治疗效果,常采用化疗、放疗、手术切除联合治疗。常规治疗通常伴随着严重的副作用、毒性或化疗耐药[2]。因此,寻找对结直肠癌有效且具有良好毒性的新药仍然是研究人员的首要任务。2,6-二异丙基苯酚(丙泊酚)不仅是临床麻醉常用的静脉麻醉剂,还被发现具有相当的非麻醉特性,包括能够预防恶心和呕吐,激活γ-氨基丁酸受体以增强镇痛,调节一氧化氮合成,并发挥抗氧化,神经保护,抗焦虑,免疫调节和抗血小板聚集作用[3]。丙泊酚还被发现通过调节microRNA表达、基因转录、细胞凋亡和免疫系统功能,抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,促进肿瘤细胞凋亡,增强对化疗药物的敏感性[4]。结直肠癌手术期间异丙酚麻醉可提高生存率,另一项研究表明,异丙酚通过促进细胞凋亡来抑制结直肠癌的肿瘤发生[5]。上述数据表明丙泊酚在抑制结直肠癌肿瘤发生方面具有有益作用,但其潜在的机制仍然知之甚少。诱导肿瘤细胞死亡是临床癌症治疗的主要策略,大多数抗癌药物通过触发细胞凋亡和细胞坏死来消除肿瘤细胞,由于癌细胞对细胞凋亡和坏死具有获得性或固有的抗性,通过这些机制诱导肿瘤细胞死亡的有效性有限。铁死亡是一种铁依赖性和活性氧(ROS)相关的细胞死亡类型,其特征是ROS的积累和细胞抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的失活,从而导致氧化还原失调。研究报道诱导铁死亡成功杀死肿瘤细胞,可抑制肿瘤生长[6]。在结直肠癌中,铁死亡的激活也被认为是一种有效疗法,其潜在机制已被广泛报道,先前的研究报道,异丙酚通过ROS介导的细胞凋亡诱导癌细胞死亡[7]。因此,假设异丙酚可能通过诱导凋亡介导的细胞死亡来抑制结直肠癌的肿瘤发生。研究发现TM2D1在肝癌中高表达,并参与其的EMT过程,与肿瘤进展相联系[8]。TM2D1在肿瘤细胞中的具体作用和机制尚待探索。因此,本研究主要探究丙泊酚通过TM2D1介导铁死亡抑制结直肠癌的分子机制。

1 资料与方法

1.1一般资料:自2020年1月至2022年1月期间收集医院接受结直肠癌根治性切除术90对结直肠癌和癌旁组织,从中选取12对结直肠癌组织和癌旁组织。患者年龄18-90岁,平均年龄(73.8±4.7)岁,男女比例1∶1。所有患者均提供了书面知情同意书,本研究获得医院伦理委员会批准(批准号:CYFYLL2022212)。排除标准如下:合并自身免疫性疾病患者;其他恶性肿瘤病史;术前放疗史;不能配合调查的老年患者。

1.2细胞培养及分组:人结直肠癌细胞系SW480购于中国科学院细胞库。细胞在DMEM (Gibco)补充10%的牛胎牛油(Gibco),并保持在37℃含5%二氧化碳的空气中,异丙酚在DMSO中稀释,后在培养基中稀释到特定浓度,SW480细胞分别用异丙酚(50μm)在室温下处理,未处理的细胞作为对照。

1.3细胞转染:利用GenScript合成人TM2D1 cDNA序列,并将其插入pcDNA3.1载体(Invitrogen),将SW480细胞(70-90%合流)接种于6孔板中,转染TM2D1基因重组载体pcDNA3.1-TM2D1 (pc-TM2D1;10 nM)或pcDNA3.1空白载体(pcDNA3.1;10 nM)使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen),根据制造商的协议,转染后,细胞接受丙泊酚处理,37℃孵育5h后,将未转染的SW480细胞和转染pc-TM2D1或pcDNA3.1的SW480细胞暴露于DMEM或添加50μm丙泊酚的培养基中。对照组将SW480细胞置于对照培养基中,不转染。48h内进行后续实验。

1.4MTT:MTT法测定细胞活力,将SW480细胞以4×103细胞/孔的密度接种到96孔板中,孵育48h后,每孔中加入10μL MTT溶液(Beyotime Institute of Biotechnology),进一步孵育4h。随后丢弃细胞培养基,向细胞中加入150μL DMSO。采用高通量通用微孔板测定法(BMG Labtech GmbH)在570nm波长处测定吸光度。

1.5菌落形成测定:在集落形成实验中,将对照组、丙泊酚组、丙泊酚+ pcDNA3.1组和异丙酚+ pc-TM2D1组的1×103SW480细胞置于3.5cm培养皿中,在添加10%胎牛血清的培养基中维持,使其形成集落,每4d更换一次培养基。培养约2周后,室温甲醇固定菌落15min,室温0.1%结晶紫染色15min,人工计数>50个细胞的染色菌落。

1.6脂质过氧化[硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)]:脂质过氧化用TBARS试剂盒检测使用含有SW480细胞(1×107/mL)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime Institute of Biotechnology),采集经异丙酚处理和/或pc-TM2D1转染的SW480细胞,移入离心管,室温下1000×g离心10min,用微孔板读卡器在535 nM处检测上述溶液的吸光度。

1.7测量总铁和Fe2+水平:铁检测试剂盒用于测量总铁和Fe2+细胞中的水平,总共2×106SW480细胞在4-0倍铁测定缓冲液中快速均质,样品在4℃下13000 × g离心10min,去除不溶性物质。为了测量总铁,在每个样品孔中加入5μL铁还原剂以将Fe3+还原为Fe2+,并用移液器将样品充分混合,后在室温黑暗中孵育30min。为了测量亚铁水平,在一组孔中向样品中加入5μL实验缓冲液,在另一组孔中加入5μL铁还原剂,将100μL铁探针添加到含有标准或测试样品的每个孔中,样品使用移液枪混合,后在室温下黑暗孵育60min。最后,在593nM处测量吸光度。

1.8ROS检测:使用2',7'-双乙酸二氯荧光素(DCFDA)-ROS试剂盒,将SW480细胞以1×105/mL的密度于6mm的培养皿中,并允许贴壁过夜,过表达TM2D1的细胞或未转染TM2D1的细胞用对照培养基或异丙酚孵育48h,用Hanks平衡盐溶液洗涤细胞,用DCFDA在37℃下孵育45min,倒置荧光显微镜下检测ROS水平。采用ImageJ软件测量。

1.9qPCR:采用TRIzol试剂(Invitrogen),根据制造商的协议,使用PrimeScriptTMRT试剂盒(Takara)在42℃下将总RNA逆转录为cDNA 30min,qPCR随后使用SYBR-Green Master PCR混合物(Applied Biosystems)的TP800热循环器DiceTM实时系统(Takara Biotechnology Co)。采用以下热循环条件:95℃初始变性10min,95℃变性15s,60℃变性1min,40个循环,最后延长至72℃延长10min,使用2-ΔΔCq方法量化TM2D1 mRNA的相对表达水平(20),并归一化为GAPDH(内参)。

1.10蛋白质印迹:使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma Chemical Co.)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime Biotech)中提取组织蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度,使用8%SDS-PAGE分离相同量的蛋白质(20μg)并转印到PVDF膜上(Bio-Rad),在室温下用5% BSA在Tris缓冲盐水(TBS)中用5% BSA封闭印迹1h,待测蛋白与抗体4℃静置过夜,后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG检测结合抗体,并用增强的化学发光试剂盒(赛默飞)可视化,使用Image J软件(美国国立卫生研究院)对条带强度进行量化。

2 结 果

2.1TM2D1在结直肠癌组织中的表达:结果显示了与癌旁组织相比,TM2D1表达水平在CRC组织中显著上调,表明TM2D1在结直肠癌中的潜在作用,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 TM2D1在结直肠癌组织中的表达

2.2丙泊酚对结直肠癌细胞增殖、集落形成能力及细胞增殖蛋白的作用:与对照组比较,丙泊酚处理显著抑制细胞增殖,对细胞集落形成起抑制作用。同样,丙泊酚处理下调了参与细胞增殖的蛋白质(包括Ki67和PCNA)的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05),见表2,图1。

图1 丙泊酚对结直肠癌的作用

表2 丙泊酚对结直肠癌的作用

2.3丙泊酚对结直肠癌细胞TM2D1表达的影响:为了确定TM2D1在CRC中的作用,分析了TM2D1在细胞中的表达水平。与对照组相比,丙泊酚降低了TM2D1表达水平,与丙泊酚组比较,过表达TM2D1组,TM2D1在SW480细胞中的mRNA和蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图2,表3。

图2 丙泊酚对TM2D1表达的影响

表3 丙泊酚对TM2D1表达的影响

2.4TM2D1对结直肠肿瘤细胞凋亡和铁死亡的影响:研究结果显示,丙泊酚刺激后CRC细胞中的铁死亡水平。与对照组比较,丙泊酚治疗TBAR、总细胞铁,Fe2+和ROS显著增加,此外,丙泊酚处理上调CHAC1和PTGS2的蛋白表达水平,而GPX4的蛋白表达水平下调,然而,与丙泊酚组比较,过表达TM2D1组与之相反,差异有统计学意义(P<0.05),见表4,图3。

图3 TM2D1对肿瘤细胞凋亡和铁死亡的影响

表4 TM2D1对肿瘤细胞凋亡和铁死亡的影响

3 讨 论

结直肠癌的高发病率和高死亡率的原因仍未确定。手术切除肿瘤是目前临床治疗结直肠癌的主要方法,手术可以促进癌症转移,因为手术允许癌细胞逃逸并进入循环系统,这是有效治疗CRC的一个迫切需要解决的重大挑战,有报道称,麻醉剂可以改善手术后患者的长期预后,特别是复发和转移[9]。越来越多的证据表明,丙泊酚可以抑制不同类型癌症的细胞增殖,包括CRC[10]。丙泊酚对结直肠癌发生和进展的影响的具体分子机制仍有待确定。本研究结果表明,丙泊酚治疗可显著促进CRC细胞铁死亡,抑制CRC细胞增殖,提示丙泊酚可能在CRC中发挥抑瘤作用。

研究显示铁死亡诱导剂(如erastin、sorafenib和sulfasalazine)已显示出有益的抗肿瘤作用,已有相关抗癌药物已被确定为铁死亡诱导剂,例如,索拉非尼被发现可以增加肝细胞癌中的脂质氧化水平,从而导致细胞死亡[11]。在胰腺癌中,热休克蛋白A5(HSPA5)/GPX4信号通路的激活诱导了对吉西他滨的耐药,而HSPA5或GPX4的敲低逆转了这种耐药,研究发现,铁死亡在这一过程中发挥了重要作用,因为已知GPX4可以减少脂质自由基的积累,防止铁死亡的发生和发展[12]。研究报道青蒿素及其衍生物在KRAS基因突变的胰腺癌细胞中引发铁凋亡,但对正常细胞的毒性作用很小,原花青素治疗显著抑制脊髓损伤患者铁、TBAR、酰基辅酶a合成酶4和花生四烯酸15-脂加氧酶B的水平,上调GSH、GPX4、核因子-红细胞2相关因子2和血红素加氧酶1的水平[13]。本研究首次发现异丙酚可以促进CRC细胞的铁死亡。铁积累和脂质过氧化为特征的铁下沉被认为与肿瘤细胞死亡有关,目前的研究结果显示,异丙酚治疗后TBAR水平以及细胞总铁和Fe2+水平均显著升高,ROS的积累是铁死亡的一个特征[14]。本研究发现在丙泊酚刺激下,CRC细胞中的ROS水平显著升高,表明丙泊酚可能诱导ROS介导的癌细胞凋亡。铁死亡受到GPX4和某些铁转运调节蛋白的严格控制,先前的一项研究报道,GPX4失活促进CRC铁下沉过程中脂质过氧化积累,活化转录因子4(ATF4)分支是主要的信号通路,CHAC1位于ATF4的下游,已被证明可促进GSH降解并随后诱导铁死亡。PTGS2在发生铁死亡的细胞中也会被诱导,但PTGS2在铁致细胞死亡级联中的确切作用仍有待阐明。先前的研究报道,抑制铁死亡诱导的PTGS2是缓解细胞死亡的有效方法。本研究分析了GPX4、CHAC1和PTGS2在丙泊酚治疗后CRC细胞中的表达水平,丙泊酚处理显著下调GPX4表达水平,上调CHAC1和PTGS2表达水平。数据表明,与其他铁死亡诱导剂一致,丙泊酚可能能够提高细胞铁水平和ROS积累,上调CHAC1和PTGS2的表达水平,下调GPX4的表达水平。

为了进一步确定丙泊酚影响的潜在机制,通过确定丙泊酚对TM2D1的调节。与邻近的正常对照组织相比,TM2D1在CRC组织中表达上调。TM2D1包含与G蛋白偶联受体超家族相关的结构模块,该结构模块具有14个跨膜结构域,可结合β-淀粉样蛋白,TM2D1以Aβ引发的半胱天冬酶依赖性方式调节神经元凋亡。最近,研究表明TM2D1也与各种癌症患者的临床结果有关,研究发现TM9D2在内的1个基因,以计算宫颈鳞状细胞癌的转录组风险评分,发现其可以识别具有不同死亡风险的患者。此外,先前的研究表明,丙泊酚通过调节CRC中STAT3/HOX转录反义RNA轴抑制细胞侵袭并促进细胞凋亡。本研究结果显示,丙泊酚治疗以浓度依赖的方式负向调节TM2D1的表达。TM2D1可调节铁死亡,抑制TM2D1可以增加细胞ROS水平,降低谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫比,TM2D1过表达也促进了细胞的迁移和侵袭。本研究通过在CRC细胞中过表达TM2D1来研究丙泊酚对CRC细胞增殖和铁凋亡的影响是否可以逆转,丙泊酚对CRC细胞增殖和集落形成的抑制作用以及丙泊酚对铁死亡的刺激作用都被TM2D1过表达显著抑制。结果表明丙泊酚可能通过下调TM2D1的表达诱导结直肠癌细胞铁死亡。

综上所述,本结果显示丙泊酚促进CRC细胞铁死亡,其潜在机制可能依赖于靶向TM2D1的表达。因此,丙泊酚诱导的铁死亡可能是CRC的一种有效治疗方向,也为CRC的治疗提供了新的思路。