基于UHPLC-Q-TOF-MS 技术分析假北紫堇入血成分及代谢产物

★ 余惠敏 李婉亭 刘海燕 何明珍,3 冯育林,3 钟国跃,3（.江西中医药大学 南昌 330006；.南昌海关技术中心 南昌 330006；3.江西本草天工科技有限责任公司 南昌 330006）

假北紫堇藏药名桑格丝哇，是罂粟科紫堇属植物，分布于甘肃南部至中部、青海东部至南部、四川西北部至西南部和西藏东部，生长于海拔2 500～4 000 m 的亚高山针叶林下或山坡路旁［1］。假北紫堇以全草入药，具有活血散瘀、清热解毒、消肿镇痛之功效［2］。化学成分研究表明，该属植物主要含有生物碱类成分，除此之外还含有黄酮、挥发油、甾体等成分［3-6］。现代药理学研究发现，该属植物具有抗肿瘤、抗炎镇痛、抗心律失常、保肝等作用［7-12］。在药理活性方面，目前多集中在提取物的药效研究，活性成分有待更进一步探究。有相关研究表明，药物进入血液后才有可能发挥疗效［13-14］。因此，有必要分析药物的入血成分，以便找到药物发挥作用的物质基础。故本实验利用中药血浆药物化学方法，结合UHPLC-Q-TOF-MS 技术，对含药血浆进行快速分析，为假北紫堇药效物质基础及药效研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Triple TOF 5600+高分辨质谱仪（美国AB Sciex公司）；LC-30A 超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Analyst TF 1.6 和PeakView 1.2 数据处理系统（美国AB Sciex 公司）；EYALA 旋转蒸发器（日本Eyala 公司）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HC-3018R 高速冷冻离心机（安徽中佳科学仪器有限公司）。

1.2 材料

假北紫堇购自西藏日喀则市江孜县，经江西中医药大学钟国跃教授鉴定为罂粟科紫堇属植物假北紫堇的干燥全草，样品标本（20200613）保存在江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。甲醇、乙腈（色谱纯，美国 Fisher Scientific 公司）；甲酸（色谱纯，西亚试剂）；超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）。SPF 级SD 雄性大鼠，体质量180～200 g，购自广东省实验动物监测所，动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0004，适应性喂养4 d，动物保持自由饮水和进食。本实验过程对动物处理均符合我国《实验动物管理条例》及江西中医药大学实验动物科技中心伦理委员会相关规定。

2 方法

2.1 假北紫堇提取物的制备

精密称取假北紫堇药材500 g，加10 倍体积70%乙醇回流提取3 次，每次时间为1.5 h，合并3 次提取液，浓缩干燥即得假北紫堇提取物，计算提取得率为21%。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取假北紫堇干燥提取物100 mg，加入10 mL 甲醇，超声，使其完全溶解，用0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 含药血浆的制备

动物适应性饲养4 d 后，将SD 大鼠随机分为空白组和给药组，每组3 只。给药前禁食12 h（可自由饮水），给药组用400 mg/kg 的假北紫堇提取物灌胃给予大鼠，提取物用适量的0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液溶解；空白组用等体积的0.5% CMC-Na 溶液灌胃给予大鼠。分别于给药后0.5、1、2、4 h 于各组大鼠眼眶取血约0.5 mL，放入2 mL 事先用肝素钠处理的EP 管中，3 500 r/min离心15 min，取上清液，即得血浆样品，并将血浆样品放置于-80 ℃冰箱中，备用。

2.4 血浆样品的预处理

将同1 组大鼠血浆涡旋混合，以减少个体差异，再分别取各组血浆200 μL，加入3 倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋混合3 min，于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。取上清液，氮气吹干，残渣用200 μL甲醇复溶，涡旋混合3 min，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，进UHPLC-Q-TOF-MS分析。

2.5 色谱条件

Welch XB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，自动进样器温度4 ℃，柱温40 ℃，流动相（A）：0.1%甲酸水；流动相（B）：乙腈。梯度洗脱，洗脱条件为：0.1～3 min，10%～15% B；3～15 min，15%～25% B；20～40 min，40%～95% B；40～42 min，95% B；42.1～45 min，10% B；进样量3 μL，流速：0.3 mL/min。

2.6 质谱条件

电喷雾离子源正离子模式，质量扫描范围m/z50～1 250，喷雾电压（ISVF）：5 500 V，雾化器温度（TEM）：550 ℃，气帘气（CUR）：30 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气（GS1、GS2）：50 psi；裂解电压（DP）：100 V，碰撞能量（CE）：30 eV，碰撞电压差（CES）：15 eV。

2.7 数据分析

通过查阅文献，对紫堇属植物的化学成分进行了汇总，包括分子式、结构式、相对分子质量、中英文名称等。建立假北紫堇化学成分数据库，利用PeakView 软件，对比分析假北紫堇提取物和含药血浆中各化合物的保留时间及二级质谱图，两者共有且二级质谱碎片相同的成分可以确认为给药组血浆中的原型成分。另通过查阅文献并结合入血原型成分的结构特点和质谱裂解规律，分析推测入血成分的代谢产物，对 UHPLC-Q-TOFMS 采集的数据进行对比分析，快速鉴定出已知化合物。

3 结果

3.1 假北紫堇 UHPLC-Q-TOF-MS 总离子流图的采集

取“2.2”“2.4”项下经处理后的供试品溶液、空白血浆样品、含药血浆样品适量，按“2.5”“2.6”项下色谱与质谱条件进样分析，获得正离子模式下的总离子流图。见图1。

图1 正离子模式下的总离子流图

3.2 假北紫堇入血成分的鉴定

含药血浆样品按照“2.5”“2.6”项下方法进样检测，将得到的质谱原始数据导入PeakView 1.2数据处理软件中，分析质谱裂解规律，结合自建的假北紫堇化学成分数据库，在给予了假北紫堇提取物的大鼠血浆中鉴定得到20 个入血原型成分，并通过筛选给药血浆样中出现的离子信号，最终在大鼠血浆中共鉴定得到13 个代谢物，代谢途径主要为甲基化、甲基羧酸化、脱水、葡萄糖醛酸化，以及复合反应等。见表1、表2。

表1 假北紫堇提取物大鼠血浆中原型成分分析的鉴定结果

化合物2：正离子模式下分子离子峰m/z146.059 8［M+H］+，tR为2.36 min， 推断其分子式为C9H7NO，碎片离子为m/z118.064 1，推测应该是母离子失去1 分子CO 所产生的，结合参考文献［15］和Mass Bank 数据库推测该化合物2 为3-吲哚甲醛，其可能的裂解途径见图2。

图2 3-吲哚甲醛的裂解途径

化合物3：正离子模式下分子离子峰m/z206.082 8［M+H］+，tR为2.37 min， 推断其分子式为C11H11NO3，碎片离子为m/z178.080 9 推测应该是母离子失去1 分子CO 所产生的，碎片离子m/z149.062 1 推测应该是继续失去1 分子CH3NH 所产生，根据其裂解特性以及文献［16］报道，推测化合物3 为Oxyhydrastinine，其可能的裂解途径见图3。

图3 Oxyhydrastinine的裂解途径

化合物5：正离子模式下分子离子峰m/z328.154 2［M+H］+，tR为3.49 min， 推断其分子式为C19H21NO4，碎片离子为m/z298.511 4 推测应该是母离子失去1 分子OCH3所产生的，碎片离子m/z297.114 1 推测应该是母离子失去1 分子NH2CH3所产生。m/z282.093 7 推测应该是碎片A 继续失去1 分子CH4所产生。碎片离子m/z237.065 2 推测是碎片A 继续失去2 分子OCH3所产生，碎片离子m/z222.080 2 推测应该是碎片B 失去1 分子OH所产生，根据其裂解特性以及文献［17］报道，推测化合物5 为10-O-methylhernovine，其可能的裂解途径见图4。

图4 10-O-methylhernovine的裂解途径

化合物13：正离子模式下分子离子峰m/z354.134 5［M+H］+，tR为7.47 min，推断其分子式为C20H19NO5，碎片离子为m/z49.060 4 和碎片A 推测是母离子RDA 裂解所产生，碎片A 会继续失去水分子或者羟基形成2 个碎片峰，根据其裂解特性以及文献［18］报道，推测化合物13 为原阿片碱，其可能的裂解途径见图5。

图5 原阿片碱的裂解途径

化合物14：正离子模式下分子离子峰m/z324.123 2［M+H］+，tR为7.81 min， 推断其分子式C19H17NO4，碎片离子为m/z149.060 1 和碎片离子为m/z176.070 1 推测是母离子RDA 裂解所产生，根据其裂解特性以及文献［19］报道，推测化合物13 为四氢黄连碱，其可能的裂解途径见图6。

图6 四氢黄连碱的裂解途径

M3 分子量比咖诺定多12 Da 为咖喏定甲基羧酸化加脱水形成，二级碎片离子m/z366.069 6 推测是A 化合物失去1 分子COOH 所产生。M5 分子量比咖诺定少36 Da，二级碎片离子m/z317.066 9 推测该入血成分为B 化合物失去1 分子CH3所产生，裂解途径见图7［20］。

图7 M3、M5的裂解途径

M6 分子量比Ochrobirine 多176 Da，二级碎片离子m/z190.097 9，与Ochrobirine 一致，推测是该入血成分为Ochrobirine 葡萄糖醛酸化结合产物，裂解途径见图8［21］。

图8 M6的裂解途径

M11 分子量比烟酰胺多14 Da，二级碎片离子m/z94.065 7 是烟酰胺甲基化失去1 分子CONH2所产生，推测该入血成分为烟酰胺甲基化结合产物，裂解途径见图9［22］。

图9 M11的裂解途径

4 结论

研究表明，UHPLC-Q-TOF-MS 技术能够快速准确分离和鉴定大鼠血浆中假北紫堇的化学成分，具有较高的分辨率，为假北紫堇入血成分的定性分析提供了一种快速、简便、可靠的分析手段。本实验采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS 法结合PeakView 1.2 软件对假北紫堇入血成分进行分析，从空白血浆、给药血浆中提取对应化合物获得相应离子流图。再基于假北紫堇所含成分和相关文献中的质谱数据对比，在大鼠给药后入血成分中共鉴定出31 个化学成分，包括20 个原型成分，以及11 个代谢产物。通过分析，假北紫堇的入血成分主要为生物碱，这类成分主要发生了甲基化、葡萄糖醛酸化、甲基羧酸化等代谢反应。据报道紫堇属中主要是生物碱成分，其中原阿片碱是典型的生物碱成分，具有良好的抗菌［23］、抗心律失常［24］、抗炎［25］作用。因此，生物碱成分可能是假北紫堇发挥药理作用的药效物质，但具体是哪些物质发挥作用及其发挥作用的机制还有待进一步研究。到目前为止，鲜有关于假北紫堇体内代谢的研究的文献报道，本实验运用高分辨质谱对假北紫堇进行体内研究，确定假北紫堇的入血原型成分，并鉴定了其代谢物，为假北紫堇的进一步开发和临床合理应用奠定理论基础。