槲皮素通过PI3K/AKT信号通路抑制奥沙利铂耐药胃癌细胞迁移

池 周,张 豪,蔡玉节,徐志娜

0 引言

2020年,我国胃癌新发及死亡病例数约为48万例、37万例,分别占全球的43.94%、48.62%[1-2]。奥沙利铂作为胃癌化疗的一线用药,其耐药可影响化疗效果,是胃癌化疗失败的重要原因[3-4]。因此,对于进展期患者,逆转奥沙利铂耐药是目前胃癌治疗中亟须解决的问题。中医药在辅助胃癌患者化疗过程中发挥重要作用[5-6]。槲皮素(Quercetin)存在于100多种抗肿瘤中草药(包括半边莲、半枝莲、白花蛇舌草等)中[7-8],其在胃癌治疗过程中的作用逐渐受到重视[9-10]。本文通过体外培养胃癌SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞,研究槲皮素对SGC-7901/L-OHP细胞迁移的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清购自美国Hyclone公司;槲皮素(纯度≥98%)购自中国药品生物制品检定所;IGF-1(PI3K激活剂)购自美国CST公司;RPMI-1640液体培养基购自美国GIBCO公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁生物;4%多聚甲醛购自上海博谷生物科技有限公司;胰蛋白酶和结晶紫染色液购自上海碧云天科技有限公司;Matrigel基质胶(354234)购自美国BD公司;MMP2抗体(40994S)、MMP9抗体(13667S)和GAPDH 抗体(2118)购自美国CST公司;p-PI3K抗体(AF3241)、p-AKT抗体(AF0016)购自Affinity公司;HRP标记山羊抗兔IgG(A0208)和HRP标记山羊抗小鼠IgG(A0216)购自上海碧云天科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和培养环境 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞以含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI-1640培养基培养,置于细胞培养箱中(饱和湿度、37 ℃、5%CO2)。

1.2.2 CCK-8测定不同浓度槲皮素对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞增殖抑制率 取对数生长期的SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞。设置0、5、10、20、30、40、50、60、70、80 μM槲皮素组,置于细胞培养箱中分别培养24 h和48 h;将96孔板中培养基更换为含10% CCK-8的RPMI-1640培养基,培养2 h后测定吸光度。

1.2.3 Transwell测定槲皮素对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞迁移的作用 分别用不含槲皮素和含槲皮素低、高剂量(10、20 μM)的培养基,将不含血清的SGC-7901/L-OHP细胞加入Transwell上室;并在下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,培养24 h后取出小室,并用棉签拭去上层未迁移细胞后,加入多聚甲醛固定并用结晶紫染色。

1.2.4 划痕实验测定槲皮素对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞迁移的作用 将SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞种于6孔板,待细胞融合达95%以上,用移液枪头划细胞单层形成划痕,并洗去划掉的细胞碎片后,用不含血清RPMI-1640培养,分别在0 h和24 h时间点进行拍照记录。

1.2.5 蛋白印迹法测定p-PI3K、p-AKT、MMP2和MMP9蛋白表达 按“1.2.3”分组处理后,按照文献方法[11]进行蛋白印迹法,抗体配比:p-PI3K(1∶500)、p-AKT(1∶500)、MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

1.2.6 IGF-1和槲皮素共处理SGC-7901/L-OHP细胞 分别设置空白组、槲皮素(10 μM)组、IGF-1 (10 μM)与槲皮素共处理组,用上述Transwell和划痕实验检测SGC-7901/L-OHP细胞迁移,用蛋白印迹法检测蛋白表达。

2 结果

2.1 槲皮素对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞增殖的影响 CCK-8实验结果显示,槲皮素作用24 h对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞的IC10分别为(21.55±2.77)、(22.10±1.49) μM (图1A),作用48 h对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞的IC10分别为(20.73±1.48)、(19.32±2.29) μM (图1B),选择10 μM、20 μM作为观察槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP迁移的低、高剂量。

图1 槲皮素对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞增殖的影响

2.2 检测SGC-7901/L-OHP细胞迁移能力 划痕实验和Transwell实验显示,与SGC-7901细胞相比,耐药细胞SGC-7901/L-OHP的划痕愈合迁移率更高(60.07%±2.19%vs.32.23%±1.91%),穿过Transwell小室的细胞数(308.330±11.9vs.165.67±19.94)更多,提示耐药细胞SGC-7901/L-OHP的迁移能力强于敏感细胞SGC-7901。见图2。

图2 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞迁移能力

2.3 槲皮素对SGC-7901/L-OHP细胞迁移的影响 细胞划痕后,分别用完全培养基和槲皮素低、高剂量(10、20 μM)培养。培养24 h后,3组的迁移率分别为44.97%±3.19%、34.86%±2.55%、25.16%±3.38%,差异有统计学意义(P<0.05);槲皮素作用SGC-7901/L-OHP细胞24 h后,对照组以及低、高剂量组中穿过Transwell小室的细胞数分别为(555±14)、(349±10)、(177±16)个,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP细胞迁移

2.4 SGC-7901/L-OHP细胞PI3K/AKT信号通路激活 与SGC-7901敏感细胞相比,耐药细胞SGC-7901/L-OHP的p-PI3K(1.84±0.11vs.1)和p-AKT(2.04±0.10vs.1)及下游的基质金属蛋白酶MMP2(2.32±0.15vs.1)和MMP9(1.92±0.05vs.1)蛋白表达量显著升高(P<0.05),而PI3K(1.03±0.05vs.1)和AKT(0.98±0.01vs.1)的蛋白表达量无显著变化(P>0.05)。见图4。

图4 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9蛋白表达

2.5 槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP细胞PI3K/AKT信号通路 Western blot结果显示,与对照组相比,槲皮素低/高剂量组p-PI3K(0.68±0.09、0.25±0.05)、p-AKT(0.64±0.03、0.16±0.03)、MMP2(0.76±0.04、0.55±0.02)和MMP9(0.84±0.02、0.70±0.01)的蛋白表达均下降(P<0.05)。见图5。

图5 槲皮素对SGC-7901/L-OHP细胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9蛋白表达的作用

2.6 槲皮素通过PI3K/AKT信号通路抑制SGC-7901/L-OHP细胞的迁移 给予PI3K激活剂IGF-1后,再给予槲皮素(10 μM),与未给予IGF-1的SGC-7901/L-OHP细胞相比,划痕愈合迁移率更大(68.50%±1.79%vs.46.17%±2.68%),穿过Transwell小室的细胞数更多(559.67±18.87vs.369.33±17.25,P<0.05)。见图6A。与未给予IGF-1的SGC-7901/L-OHP细胞相比,IGF-1与槲皮素共处理组的p-PI3K(0.98±0.01vs.0.82±0.06)、p-AKT(0.96±0.02vs.0.41±0.02)、MMP2(0.98±0.01vs.0.60±0.04)和MMP9(0.99±0.01vs.0.77±0.07)蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图6B。

图6 IGF-1与槲皮素共处理对SGC-7901/L-OHP细胞迁移和蛋白表达的影响

3 讨论

除手术切除外,化疗是胃癌最重要的治疗手段,可在手术前、中、后进行。晚期胃癌或其他原因不能手术者也可做化疗,但胃癌的化疗耐药是治疗失败的主要原因之一[12]。化疗的主要目的是抑制癌细胞扩散和杀伤残存癌细胞,因此,其化疗耐药的表现之一是胃癌细胞更容易迁移而发生远处转移。本研究显示,胃癌耐药细胞(SGC-7901/L-OHP)的迁移能力高于敏感细胞(SGC-7901)。细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解是肿瘤发生远处转移的重要步骤,癌细胞只有降解ECM并进入血液循环,才能转移到全身各处[13]。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白水解酶,其中MMP2和MMP9在胃癌组织中阳性表达率高于癌旁组织,而且MMP9会随着胃癌浸润深度增加而出现高表达[14-16]。本研究中,胃癌耐药细胞(SGC-7901/L-OHP)的MMP2和MMP9蛋白表达高于敏感SGC-7901细胞。

PI3K/AKT信号通路在胃癌的发病机制中较为重要,可抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖、血管新生及远处转移等[17]。研究表明,PI3K/AKT通路异常激活是胃癌化疗耐药的重要原因[18]。本研究显示,SGC-7901/L-OHP的p-PI3K和p-AKT蛋白表达明显高于SGC-7901,也间接证实这一研究结果。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物,具有广泛的药理学作用,包括抗炎、抗癌、抗氧化及清除自由基等作用[19-20],其对包括胃癌在内的多种肿瘤有抑制作用[10],其联合化疗能抑制胃癌细胞的增生,促进凋亡[9,21-22]。本研究分析槲皮素对SGC-7901和SGC-7901/L-OHP细胞增殖的影响,确定IC10值,排除槲皮素对SGC-7901/L-OHP增殖的影响,确定10 μM、20 μM作为槲皮素测定SGC-7901/L-OHP细胞迁移的实验剂量,结果显示,槲皮素在体外能抑制SGC-7901/L-OHP细胞的迁移能力。

槲皮素处理SGC-7901/L-OHP细胞后,Western blot结果显示,槲皮素能够抑制MMP2和MMP9蛋白表达,表明槲皮素可能通过抑制ECM降解过程抑制胃癌耐药细胞迁移,其机制可能是抑制上游p-PI3K、p-AKT的表达。因此,槲皮素可能通过调控PI3K/AKT通路抑制SGC-7901/L-OHP细胞的迁移。为进一步验证假设,本研究采用PI3K激活剂IGF-1与槲皮素联合处理SGC-7901/L-OHP细胞,结果显示,其能降低槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP细胞迁移的作用,并拮抗槲皮素诱导的p-PI3K、p-AKT、MMP2和MMP9表达下降能力,提示槲皮素是通过调控PI3K/AKT通路抑制SGC-7901/L-OHP细胞迁移。

综上,本研究表明,槲皮素能够在体外抑制SGC-7901/L-OHP细胞的迁移能力,其机制可能是通过调控PI3K/AKT信号通路抑制ECM的降解过程而实现的。此外,本研究仅通过体外细胞实验验证,其在体内抑制胃癌耐药细胞转移的效果和机制有待进一步探索。