亚精胺通过改善心脏线粒体能量代谢缓解压力超负荷小鼠心力衰竭*

张晓亮， 赵晓玲， 耿 静， 胡 朗， 李 妍△

（1空军军医大学唐都医院心内科， 陕西 西安 710032；2中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院超声诊断科，甘肃 兰州 730050）

心力衰竭作为一种复杂且致命的临床综合征，具有发病率和死亡率高，患者生活质量下降以及治疗费用高的特点。心力衰竭在全球范围内影响超过了6400万人［1］。《中国心血管健康与疾病报告2022》指出，随着我国人口老龄化及城镇化进程不断加速，心血管病的危险因素对健康的影响越加显著，并且心血管病发病率仍持续增高，其中心力衰竭患者超过890万人［2］。探索心力衰竭的潜在发病机制，并提出针对性的防治措施对于心衰的临床治疗有着重要意义。

亚精胺（spermidine， SPD）是一种天然的多胺，既往的研究表明外源性补充SPD有助于改善与衰老相关的心脏、神经、肝脏以及免疫功能的下降［3］。一项在衰老小鼠中的研究表明，膳食补充SPD可以改善衰老小鼠的大脑线粒体功能以及认知能力［4］。而在肿瘤中，SPD可以直接激活线粒体三功能复合体进而促进小鼠的抗肿瘤免疫能力［5］。同时，既往报道SPD可以通过促进心肌细胞线粒体生成改善衰老小鼠出现的心功能障碍［6］。心脏作为持续收缩做功而消耗大量能量的器官，线粒体对其正常的能量生成代谢至关重要［7］。线粒体能量代谢受损是心力衰竭公认的关键致病因素［8］。鉴于SPD与线粒体功能联系密切，本研究旨在讨论SPD对压力超负荷心力衰竭小鼠的改善作用，并探讨其依赖于心肌线粒体能量代谢的具体机制。

材料和方法

1 实验动物

8周龄的野生型C57BL/6J小鼠和1～3日龄SD大鼠乳鼠均购自空军军医大学动物中心。所有小鼠均在恒温恒湿动物房中饲养。所有动物实验的设计和操作程序经第四军医大学动物伦理委员会批准。

2 主要试剂及仪器

沉默信息调节因子6（silent information regulator 6， SIRT6）抗体、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1， PGC-1）抗体及抗兔和鼠Ⅱ抗均购于Signalway Antibody；GAPDH和线粒体融合蛋白2（mitofusin 2， MFN2）抗体均购于中国三鹰生物技术有限公司；SIRT6siRNA （siSIRT6）购于汉恒生物科技有限公司；BCA定量试剂盒和鬼笔环肽细胞骨架染色剂均购于Thermo Fisher；超敏ECL发光液购于陕西普罗安蒂生物科技发展有限公司；Ⅱ型胶原酶购于上海生工；MitoTracker Green和4′，6-二脒基-2苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染色液购于碧云天公司；三溴乙醇购于展帆生物有限公司；SPD购于上海阿拉丁公司。Langendorff心脏灌流系统购于成都仪器厂；小动物呼吸机购于Harvard Apparatus；小鼠心脏超声系统购于飞依诺公司；Oxygraph-2k高分辨能量代谢仪购于Oroboros Instruments；酶标仪和荧光显微镜购自Thermo Fisher；Western blot发光系统购于Bio-Rad；共聚焦显微镜购于Leica。

3 主要方法

3.1 主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction，TAC）造模 将8周龄小鼠随机分为4组，分别为假手术（sham）组、单纯SPD喂养组（sham+SPD组）、TAC组和TAC+SPD组。通过TAC手术建立心脏压力超负荷小鼠模型［9］：利用三溴乙醇麻醉小鼠，利用小动物呼吸机行气管插管后进行手术操作，利用27号针和6-0尼龙线将右颈无名动脉与左颈动脉之间的横主动脉缩窄。对于sham组，在周龄匹配的小鼠身上进行了相同的操作，只省略了实际的横主动脉缩窄。TAC术后饮水添加3 mmol/L SPD喂养6周［3］，之后进行后续实验操作。

3.2 超声心动图检查 TAC术后6周后，提前24 h

脱去小鼠胸前毛发。用异氟烷混合纯氧持续吸入麻醉小鼠，将小鼠放置于恒温操作板上，超声探头置于小鼠胸骨旁，取左室长轴切面，获取M型超声心动图。用超声心动仪配套软件测算左心室射血分数（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）、收缩期室间隔厚度（interventricular septal thickness during systole， IVSs）和舒张期室间隔厚度（interventricular septal thickness during diastole， IVSd）。

3.3 成年小鼠心肌细胞的分离 使用先前描述的方案分离成年小鼠心肌细胞［10］。利用Langendorff灌流系统用含Ⅱ型胶原酶的消化液灌注消化小鼠心脏，消化完全后获得细胞悬液，重力沉淀差速分离心肌细胞和成纤维细胞。取富含心肌细胞的底层细胞沉淀，梯度复钙后对心肌细胞进行后续分析。

3.4 透射电子显微镜观察心肌线粒体 取小鼠心脏后将左心室组织切成1 mm×1 mm×1 mm组织块，将组织置于2.5%戊二醛中固定过夜。脱水包埋处理后烘箱内固化，超薄切片机切片，使用300 kV透射电镜观察不同视野的心肌线粒体形态，获得图像，并使用ImageJ软件进行分析，计算单位面积内线粒体数目及线粒体嵴密度。

3.5 心肌线粒体功能测定 利用Oxygraph-2k高分辨呼吸能量代谢仪测定线粒体的耗氧量，以评估线粒体功能。先迅速分离20 mg小鼠心肌组织，置于4 mL提前预冷的呼吸介质miR05中将组织匀浆化，上述步骤均在冰上进行。将组织匀浆加入2 mL腔室，并加入不同线粒体复合物所需底物以测定线粒体呼吸链复合物功能［11］。

3.6 Western blot 分别取各组小鼠心脏相同位置20 mg组织，将组织置于PBS中剪碎，并用PBS清洗3次，之后加入RIPA裂解液于超声上进一步裂解。静置30分钟后离心取上清。以上过程均在4 ℃低温条件下进行。取上清液进行BCA蛋白定量。原代心肌细胞提取蛋白先用PBS轻柔冲洗细胞，洗去残余培养液，随后添加RIPA裂解液，后续步骤与组织提取蛋白相同。根据定量结果调整各样本上样体积，按照Western blot实验流程进行操作，采用10% SDSPAGE凝胶分离蛋白，转至PVDF膜。5%脱脂奶粉常温封封闭1 h。1× TBST溶液漂洗，4 ℃条件下Ⅰ抗（SIRT6、PGC-1和MFN2抗体，均1∶1 000稀释）孵育过夜。1× TBST溶液漂洗3次。室温下羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000稀释）孵育90 min，1× TBST溶液漂洗3次。配制超敏ECL发光液（A液和B液1∶1配制），用化学发光法检测目的蛋白条带，用蛋白印迹成像系统记录条带，组织以GAPDH为内参蛋白进行目的蛋白定量分析，细胞以β-actin为内参蛋白进行目的蛋白定量分析。

3.7 原代大鼠心肌细胞的分离、培养和细胞实验分组 将1～3日龄SD大鼠乳鼠在75%酒精中充分浸泡，乳鼠体表消毒后转移至超净台内，迅速摘取乳鼠心脏，置于无菌PBS中，清洗干净心脏血液，充分剪碎乳鼠心脏，置于无菌玻璃瓶中。加入1 g/L的Ⅱ型胶原酶5 mL，胶头滴管反复轻柔吹打混匀心肌组织，用无菌瓶盖密封玻璃瓶，在37 ℃孵箱中消化心肌组织5 min，轻柔吸取上层消化液，加入含10%胎牛血清DMEM培养液的5 mL离心管中以终止消化。重复消化5～6次直至心肌组织消化完毕。收集消化后所得细胞混悬液，室温下800×g离心5 min，弃上清后所得沉淀即为原代心肌细胞和成纤维细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬沉淀后种植于小培养瓶，37 ℃孵箱中静置2 h，差速贴壁使成纤维细胞贴壁，此时原代心肌细胞未贴壁而处于悬浮状态。最后，将小培养瓶中的培养液转移至6孔板培养48 h，原代心肌细胞即可充分贴壁。原代心肌细胞分为对照（control， Con）组、Con+SPD （1 mmol/L）组、血管紧张素II（angiotensin II， Ang II；1 μmol/L）组、Ang II+SPD组和Ang II+SPD+siSIRT6组。

3.8 形态学观察 小鼠安乐死后，取心脏组织，用PBS溶液冲洗，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm切片。麦胚凝集素（wheat germ agglutinin， WGA）染色观察心肌细胞横截面积大小。Masson染色评估心肌纤维化。定量测量使用ImageJ软件。

4 统计分析

用GraphPad Prism 8软件进行分析。所有数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析进行组间比较，进一步两两比较使用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TAC小鼠心功能下降，心脏肥大，心肌组织SIRT6、PGC-1和MFN2蛋白表达水平下降

TAC术后6周，超声结果显示TAC组小鼠LVEF和LVFS均显著下降（P＜0.05），即心脏收缩功能下降，见图1A；肉眼可见TAC组小鼠心脏较sham组明显变大，见图1B；与sham组相比，TAC组小鼠心肌组织中SIRT6、PGC-1和MFN2蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05），见图1C。

Figure 1.Transverse aortic constriction（TAC） induced cardiac hypertrophy， and decreased cardiac function and protein expression levels of silent information regulator 6（SIRT6）， peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1（PGC-1） and mitofusin 2 （MFN2）.A： representative images of echocardiography of mice in each group and statistical charts of left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular fractional shortening （LVFS）；B： representative images of gross mouse heart specimens；D： the expression levels of SIRT6， PGC-1 and MFN2 in heart tissues were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group.图1 TAC小鼠心功能下降，心脏肥大，心肌组织SIRT6、PGC-1和MFN2表达水平下降

2 SPD对TAC小鼠心脏肥大和心肌细胞肥大的影响

心脏大体照片显示，SPD喂养逆转了TAC组小鼠心脏肥大，降低了TAC组小鼠心重比体重和心重比胫骨长（P＜0.05），见图2A。利用Langendorff灌流急性分离4组小鼠的成年心肌细胞，进行心肌细胞骨架染色后用共聚焦显微镜观察，TAC组小鼠心肌细胞长度和宽度均高于sham组（P＜0.05），而SPD缓解了心肌细胞的肥大（P＜0.05），见图2B。WGA染色也发现SPD减轻了TAC诱导的心肌细胞横截面积增大（P＜0.05），见图2C。对比于sham组，sham+SPD组上述指标均未见显著差异（P＜0.05），见图2A～C。

Figure 2.Effects of spermidine （SPD） on cardiac hypertrophy and hypertrophy of cardiomyocytes in mice with transverse aortic constriction （TAC）.A： representative images of gross mouse heart specimens， and statistical charts of the ratio of heart weight to body weight（HW/BW） and the ratio of heart weight to tibia length （HW/TL）；B： representative images of phalloidin（red） and DAPI （blue） staining showing the cytoskeleton of the adult cardiomyocytes （scale bar=10 μm）， and quantitative analysis of the adult cardiomyocyte length and width；C： representative wheat germ agglutinin （WGA） staining images and quantitative analysis of cell area.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs TAC group.图2 亚精胺对TAC小鼠心脏肥大和心肌细胞肥大的影响

3 SPD对TAC小鼠心肌组织SIRT6、PGC-1和MFN2表达及线粒体质量的影响

Western blot结果显示，SPD喂养增加了TAC组小鼠心肌组织SIRT6、PGC-1和MFN2蛋白表达水平（P＜0.05），见图3A。同时利用透射电镜观察心肌组织线粒体发现，相较于sham组，TAC组小鼠心肌线粒体内线粒体嵴密度降低（P＜0.05），单位面积内线粒体数目减少（P＜0.05），线粒体排布不规则，而SPD喂养增加了TAC组小鼠心肌线粒体数目和线粒体嵴密度（P＜0.05），见图3B。

Figure 3.Effects of spermidine （SPD） on SIRT6， PGC-1 and MFN2 expression levels and mitochondrial quality in transverse aortic constriction （TAC） mice.A： the protein expression of SIRT6， PGC-1 and MFN2 in mouse heart tissues of each group；B：representative transmission electron microscopic images of the myocardium （scale bar=1 μm）， and determinations of the ratio of cristal area to mitochondrial area and the number of mitochondria per μm2.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs TAC group.图3 亚精胺对TAC小鼠SIRT6、PGC-1和MFN2表达水平及线粒体质量的影响

4 SPD对TAC小鼠线粒体功能、心肌纤维化和心功能的影响

使用Oxygraph-2k高分辨能量代谢检测仪的底物-解偶联剂-抑制剂滴定（substrate-uncoupler-inhibitor titration， SUIT）方案［12-13］来评估小鼠心肌线粒体功能，通过测定小鼠心肌组织线粒体复合物的耗氧率（oxygen consumption rate， OCR）来量化线粒体呼吸功能。与sham组相比，加入丙酮酸（pyruvate）、谷氨酸（glutamate）和苹果酸（malate）后，线粒体复合物I的OCR在TAC组中下降，而TAC+SPD组线粒体复合物I的功能改善（P＜0.05）；加入琥珀酸（succinate）测定线粒体复合物II的OCR，SPD同样改善了TAC组中下降的线粒体复合物II功能（P＜0.05）；加入抗坏血酸（ascorbate）和N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺（N，N，N′，N′-tetramethyl-p-phenylenediamine， TMPD），与TAC组相比，TAC+SPD组中线粒体复合物IV的功能也得到了改善（P＜0.05）；与sham组相比，sham+SPD组线粒体复合物I、II和IV的功能也有了一定程度的增强（P＜0.05），见图4A。Masson染色显示，与sham组相比，sham+SPD组小鼠心肌组织无明细差别，而TAC组心肌纤维化程度增高（P＜0.05）；相较于TAC组，SPD喂养减少了TAC组小鼠心肌纤维化面积（P＜0.05），见图4B。TAC术后6周超声结果显示，相比于TAC组，TAC+SPD组小鼠心脏收缩功能改善，LVEF和LVFS均高于TAC组（P＜0.05），心肌肥大的指标IVSs和IVSd，TAC+SPD组也均低于TAC组（P＜0.05），与大体观测结果（图2A）一致，见图4C。

Figure 4.Effects of spermidine（SPD） on mitochondrial function， myocardial fibrosis and cardiac function in transverse aortic constriction（TAC） mice.A： representative experiment for determining mitochondrial oxidative phosphorylation （OXPHOS）capacity using Oxygraph-2k instrument， and statistical charts of mitochondrial OXPHOS capacity of complexes I， II and IV；B： representative Masson staining images of mouse heart tissues in each group （scale bar=50 μm） and quantitative analysis of interstitial fibrosis；C： representative images of M-mode echocardiography， and determinations of left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular fractional shortening （LVFS）， interventricular septal thickness during systole（IVSs） and interventricular septal thickness during diastole （IVSd）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs TAC group.图4 亚精胺对TAC小鼠线粒体功能、心肌纤维化和心功能的影响

5 SPD对Ang II诱导的原代大鼠心肌细胞SIRT6、PGC-1和MFN2表达及线粒体形态的影响

Western bolt结果显示，Ang II刺激24 h后心肌细胞SIRT6、PGC-1和MFN2蛋白表达水平均较Con组显著下降（P＜0.05）；而Ang II+SPD组SIRT6、PGC-1和MFN2蛋白表达水平较Ang II组显著升高（P＜0.05），见图5A。利用鬼笔环肽染色细胞骨架，DAPI染色细胞核，对比Con组，Ang II刺激后心肌细胞出现肥大，Ang II+SPD组缓解了心肌细胞肥大（P＜0.05），见图5B。利用MitoTracker Grenn染色心肌细胞线粒体，共聚焦显微镜观察显示，对比Con组，Ang II组线粒体的数目显著减少，线粒体的平均面积显著缩小（P＜0.05），而SPD缓解了线粒体数目的减少及平均面积的缩小（P＜0.05），见图5C。

Figure 5.Effects of spermidine（SPD） on expression of SIRT6， PGC-1 and MFN2 and mitochondrial morphology in primary rat cardiomyocytes induced by angiotensin II （Ang II）.A： the protein expression of SIRT6， PGC-1 and MFN2 determined by Western blot；B： representative fluorescence microscopic images showing cell area stained by phalloidin （scale bar=20 μm） and statistical charts of cell area；C： representative confocal microscopic images showing mitochondrial morphology stained by MitoTracker Green （scale bar=20 μm）， and statistical charts of mitochondrial number per cell and mean mitochondrial volume ［fold over congtrol （Con） group］.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs Ang II group.图5 亚精胺对Ang II诱导的原代大鼠心肌细胞SIRT6、PGC-1和MFN2表达及线粒体形态的影响

6 转染siSIRT6后SPD对Ang II诱导的原代大鼠心肌细胞SIRT6、PGC-1和MFN2表达及线粒体形态的影响

为验证SPD是否通过SIRT6缓解心肌肥大及改善线粒体形态，分离原代心肌细胞后，利用siSIRT6干扰SIRT6的表达。转染siSIRT6后，Ang II刺激24 h，Ang II+SPD+siSIRT6组SIRT6、PGC-1和MFN2蛋白表达水平较Ang II+SPD组不再升高（P＜0.05），见图6A；细胞骨架染色提示，siSIRT6消除了SPD对细胞肥大的逆转作用（P＜0.05），见图6B；心肌细胞线粒体染色提示，siSIRT6消除了SPD对线粒体形态的改善作用（P＜0.05），见图6C。

Figure 6.Effects of SIRT6 siRNA （siSIRT6） combined with spermidine （SPD） on expression of SIRT6， PGC-1 and MFN2 and mitochondrial morphology in primary rat cardiomyocytes induced by angiotensin II （Ang II）.A： the protein expression of SIRT6， PGC-1 and MFN2 detected by Western blot；B： representative fluorescence microscopic images showing cell area stained by phalloidin （scale bar=20 μm） and statistical charts of cell area；C： representative confocal microscopic images showing mitochondrial morphology stained by MitoTracker Green （scale bar=20 μm）， and statistical charts of mitochondrial number per cell and mean mitochondrial volume ［fold over congtrol （Con） group］.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs Ang II group.图6 转染siSIRT6后亚精胺对Ang II诱导的原代大鼠心肌细胞SIRT6、PGC-1和MFN2表达及线粒体形态的影响

讨 论

病理性心肌肥大作为心脏压力超负荷的重要特征，常常伴随着多种不良的心血管事件，包括心力衰竭、心律失常、心源性猝死等［14］。作为一种心室代偿反应，病理性心肌肥大以单个心肌细胞延长为特点，然而最终会进展为心室扩张、室壁变薄和收缩功能障碍［15］。在病理性肥大进展为心力衰竭的过程中，线粒体功能障碍，线粒体质量控制系统紊乱促进了心肌病理性重塑的进程［14］。心脏能量代谢的变化往往早于心力衰竭发生，在病理性肥大情况下，心脏能量代谢的适应性受损加剧了病理性肥大［16-17］。心肌细胞的加速死亡和ATP产生效率的下降都直接导致心脏收缩功能下降进而发生心力衰竭［18-19］。因此，本研究聚焦于SPD能否通过能量代谢途径缓解压力超负荷小鼠病理性心肌肥大和心力衰竭，提出了潜在的治疗靶点。

SIRTs蛋白家族是一类依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+）的第III类组蛋白脱乙酰酶［20-21］。在病理性心肌肥大和心力衰竭时，由于NAD+水平降低和SIRTs蛋白失活，线粒体蛋白发生高度乙酰化［22-24］，从而加速了能量代谢紊乱和心力衰竭的发展。SIRT6蛋白大部分定位于细胞核内［25］，在应激反应时也可以移位至细胞质内［26］。SIRT6在功能上与SIRT1具有相似性，但SIRT6不仅具有去乙酰化的活性，也是ADP核糖基转移酶，在细胞内发挥能量传感器及稳态调节的作用［27］。既往的研究表明，SIRT6的活性失调导致了代谢性疾病、心血管疾病、癌症、骨骼肌和神经退行性疾病的发生与进展［28-29］。一项研究发现，小鼠心脏特异性敲除SIRT6后，出现心肌肥大及纤维化，乃至心力衰竭，而心脏特异性过表达SIRT6可通过胰岛素样生长因子的去乙酰化抑制TAC诱导的肥大［30］。过去研究表明，SPD可通过SIRT1在心脏衰老和血管钙化中发挥心血管保护作用［6，31］。本研究中，TAC 6周后心衰小鼠心肌组织中SIRT6蛋白表达下降，与既往研究结果一致［30］，而SPD的补充缓解了SIRT6蛋白的降低，减轻了心功能障碍，改善了线粒体功能。

PCG-1是调控线粒体生物发生的核受体转录辅激活因子，乙酰化会导致其功能降低进而引发线粒体生成不足，线粒体功能障碍［32-33］。本研究结果显示，心衰小鼠心肌组织中PGC-1表达水平下降，电镜观察发现线粒体数目减少，线粒体嵴密度降低，在Ang II处理的原代大鼠心肌细胞中也观察到了线粒体减少与紊乱，而SPD上调了SIRT6的水平进而促进了PGC-1表达，改善了线粒体质量。利用siSIRT6干扰SIRT6的表达后，SPD对Ang II组心肌细胞PGC-1和MFN2表达水平的升高作用、对心肌细胞肥大的逆转作用和对线粒体质量的改善作用消失，提示SPD改善效应的途径可能是SIRT6依赖的。

心肌细胞不具有强大的能量贮存能力，ATP必须持续产生以满足心脏的收缩需求［34］。衰竭的心脏被描述为“燃料耗尽引擎”，其对能量需求的增加超过了能量供应能力，导致了需求和供应之间的不平衡［19］。心力衰竭时，心脏中的高能磷酸盐含量下降50%～70%，在终末期的心衰中，ATP含量下降了30%［35-37］。线粒体作为细胞能量代谢中心，通过氧化磷酸化产生ATP满足心脏的能量需求［38］。同时，心脏的线粒体底物代谢重塑，可以作为心力衰竭的早期诊断标志［39］。作为维持线粒体完整结构及正常能量代谢功能的重要前提，线粒体拥有通过裂变、融合和自噬来调控自身的质量控制系统［40］。既往研究表明，作为线粒体融合的重要分子，MFN2的缺失会损伤线粒体呼吸链的氧化磷酸化代谢能力［41-42］。本研究结果表明，压力超负荷心衰小鼠心肌组织中的MFN2表达水平下降，线粒体氧化磷酸化能力下降，心功能下降；外源SPD的摄入上调了心衰小鼠心肌组织中的MFN2表达水平，改善了心衰小鼠的线粒体动力学和氧化磷酸化能力。原代心肌细胞在Ang II处理的同时给予SPD，可上调MFN2水平，缓解Ang II导致的线粒体紊乱及细胞肥大。

综上所述，本研究发现，SPD可以缓解压力超负荷小鼠心力衰竭，改善心脏收缩功能，减轻心肌肥大重塑，抑制心肌纤维化，恢复心衰小鼠线粒体稳态，提高线粒体氧化磷酸化能力，挽救心衰小鼠的能量缺乏。本研究进一步探索了SPD在心力衰竭治疗中的潜在临床价值。