PDHA1促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移*

李佳琪， 孙 勇， 李 乐， 李 媛， 范 骏， 孔之华， 毛晓韵， 戴 勇△

（1暨南大学基础医学与公共卫生学院医学生物化学与分子生物学系，广东 广州 510632；2广东省中西医结合医院，广东 佛山 528200；3中国医科大学附属第一医院乳腺外科，辽宁 沈阳 110001）

据2022年病例统计，乳腺癌是全球女性中最常见的癌症，占比31%。而乳腺癌的高发病率成为引起全世界妇女残疾、死亡的主要诱因［1］。雌激素受体（estrogen receptor， ER）、孕激素受体（progesterone receptor， PR）和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）是乳腺癌诊断的重要生物表型标志物，因此通过乳腺癌组织病理学诊断、激素受体和生长因子受体的表达水平可将乳腺癌继续划分为三个亚型：（1）表达激素受体乳腺癌：ER+或PR+；（2）HER2+乳腺癌；（3）三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC），ER-、PR-和HER2-［2-7］。诊断中含有ER、PR和HER2阳性的乳腺癌亚型因为有明确的靶标，已经开发出具有针对性的治疗方案［8-11］，而TNBC由于缺乏明确的驱动基因，目前还没有效果良好的靶向治疗方案。因此，迫切需要确定TNBC中潜在的可药物靶点以进行有效治疗。近年来，代谢重编程已成为癌细胞的标志，糖代谢重编程包括有氧糖酵解和氧化磷酸化的改变是癌细胞显示出的独特代谢表型以促进细胞进展和转移。通过探索糖代谢重编程相关重要基因和蛋白的表达与功能的变化将有助于揭示TNBC发生发展的特点，为寻找新可药物靶点提供理论依据。

位于线粒体中的丙酮酸脱氢酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex， PDHC）是桥接糖酵解和氧化磷酸化的关键因子［12］，负责将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，后者进入三羧酸循环和氧化磷酸化，与乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶一起，共同调节丙酮酸是转变为乳酸还是乙酰辅酶A，从而决定细胞代谢模式是依赖糖酵解还是依赖三羧酸循环。丙酮酸脱氢酶E1亚基α1（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1）是PDHC中的关键酶，直接催化丙酮酸转化乙酰辅酶A，其酶活性受丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase， PDK）和丙酮酸脱氢酶磷酸酶（pyruvate dehydrogenase phosphatase 1， PDP1）共同调控。PDK在S293等位点磷酸化PDHA1，抑制其酶活性；PDP1则通过解除PDHA1磷酸化状态，激活PDHA1活性。之前的研究表明，多种酪氨酸激酶与乙酰辅酶A乙酰基转移酶能够通过酪氨酸磷酸化、乙酰化等翻译后修饰调控PDHC构成以及PDHA1、PDK和PDP1活性等方式促成肿瘤细胞代谢从线粒体三羧酸循环氧化磷酸化通路向有氧糖酵解通路的转变［13-19］。但是，PDHA1蛋白水平的变化对乳腺癌特别是对TNBC增殖、转移和预后的影响目前尚不完全清楚。本研究通过生物信息学分析、体外细胞实验、患者样本免疫组化染色等方法解析了PDHA1表达在乳腺癌特别是TNBC中发生、发展和转移中的作用及其病理生理意义，为进一步探索将调控PDHA1作为治疗TNBC的新靶点奠定理论基础。

材料和方法

1 组织样本

本研究课题中所涉及的临床样本组织来自中国医科大学附属第一医院，对应患者信息见表1。所有样本检测经过暨南大学医学伦理委员会审查并严格按照医学伦理规范和要求进行。

表1 临床组织样本患者基本信息Table 1.Basic information of the patients and clinical tissue samples

2 主要试剂

高糖型DMEM培养液购于Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购于广州康凯信生物科技有限公司；胰蛋白酶（含酚红和EDTA）和双抗（青霉素和链霉素）和嘌呤霉素均购于凯基生物科技有限公司；兔抗人PDHA1抗体（sc-377092）购于Santa Cruz；兔抗人E-cadherin抗体（3195s）、兔抗人N-cadherin抗体（13116S）和兔抗人vimentin抗体（5741S）购于Cell Signaling Technology；鼠抗人β-actin抗体（26F7）购于华安生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于BioSharp；Tween-20购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

3 实验方法

3.1 生物信息学分析 UALCAN数据库用于分析PDHA1在正常乳腺组织与不同分子分型的乳腺癌组织中的表达。调用TCGA-BRCA数据集中BRCA表达谱分析PDHA1在乳腺癌T、N、M各分级阶段和不同亚型中的表达差异；利用KM-plotter数据库分析PDHA1表达水平与生存预后的相关性［20-21］。基于PDHA1的表达量，采用R软件的DESeq2程序包分别对高、低表达PDHA1乳腺癌患者的RNA测序数据进行差异分析，对差异基因进行基因本体（Gene Ontology， GO）注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。String数据库为PHDA1蛋白及其相互作用蛋白提供可视化。

3.2 免疫组化检测 将组织切片置入60 ℃烤箱溶蜡，随后将切片依次放入四盒100% xylene、100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、30%乙醇中各5 min，使用甲醇-双氧水混合物浸泡将内源性过氧化物酶失活后，放入微波炉在煮沸的1× citrate buffer中煮沸10 min。然后将组织切片移出冷却至室温，对组织切片滴上normal horse serum（2.5%）和亲和素的混合液进行室温封闭，接着加入相应Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，室温孵育Ⅱ抗，然后加入DAB显色液和苏木精染核，最后放入60 ℃烘箱烤干封片，进行拍照记录。

3.3 Western blot实验 将细胞从培养箱拿出，弃去培养液进行PBS润洗，再加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解，将细胞碎片刮下来，移至1.5 mL EP管中，提取细胞总蛋白。吸取部分细胞裂解液用于BCA蛋白定量实验，调齐后等量上样，剩余细胞裂解液加入5× SDS-PAGE样品loading buffer，充分混匀，样品煮沸变性，直接进行免疫印迹法分析。将蛋白样品进行SDS-PAGE、转膜，5% BSA室温下封闭膜1 h，加入相应Ⅰ抗（PDHA1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin抗体，1∶1 000稀释；β-actin抗体，1∶10 000稀释）4 ℃摇床孵育过夜。用TBST清洗后室温孵育相应的抗兔、抗鼠Ⅱ抗，最后使用ELC发光液显影拍照存档。

3.4 细胞培养 人TNBC细胞系MDA-MB-231购自Procell。37 ℃、5% CO2的培养箱内培养MDA-MB-231细胞，配制10% FBS和1%双抗（青霉素和链霉素）的高糖型DMEM培养液培养细胞。当细胞密度达到90%左右时，弃去培养液，用无菌PBS润洗2遍，随后加入适量胰酶消化，用新鲜培养液终止消化，并按1∶3的比例进行细胞传代。

3.5 包装病毒 HEK293FT在6孔板密度为70%左右时转染，将包装质粒和目的质粒以及PEI分别加入200 μL培养液静置5 min，再混合静置20 min，置入培养皿中，转染后6 h换液，24或48 h收集培养皿上清液即为病毒液，收集后以1 000×g离心5 min，立即使用或-80 ℃冻存。

3.6 构建稳定细胞系 选择pLVX3-Hygpmycin载体，选择XhoI限制性核酸酶对其进行单酶切，采用无缝克隆方法，设计过表达引物，构建pLVX3-Hyg-PDHA1质粒（正向引物序列为5'-CGGCCGCAGGTCTCGAGGTGAGGAAGATGCTCGCCGC-3'，反 向引物序列为5'-ACTACTTATTCACTCGATTAACTGACTGACTTAAACTT-3'）。选择V2载体，构建V2-PDHA1质粒（正向引物序列为5'-CACCGGGTGTCCTTACTCTCAGCCC-3'，反向引物序列为5'-AAACGGGCTGAGAGTAAGGACACCC-3'）。将V2-PDHA1、阴性对照V2、pLVX3-Hygpmycin和pLVX3-Hyg-PDHA1质粒包装成病毒［22］。待目的细胞在6孔板中的密度为60%时，更换培养液，加入1 mL新鲜培养液（0.001%聚凝胺）中，37 ℃孵育30 min，将病毒液与培养液等比例加入，感染MDA-MB-231细胞，24 h后换液加入嘌呤霉素筛选培养。

3.7 细胞增殖实验 将细胞每孔10×104个接种于6孔板中，待细胞贴壁后，每天计数细胞数量，第3天将每孔细胞逐个传代到6 cm培养皿中，每孔重复计数3次，连续计数6 d。

3.8 细胞划痕实验 将细胞接种于6孔板中，待细胞均匀长满每个孔后，用无菌200 μL吸头笔直地在每个孔中划痕，更换成1% FBS和1%双抗（青霉素和链霉素）的高糖型DMEM培养液培养细胞，进行第一次拍照，然后每隔24 h拍照记录。

3.9 集落形成实验 将目的基因稳定敲除和对照细胞按照每孔800个接种于6孔板中，每种细胞培养3个孔，当单个细胞集落长至肉眼可见时，从培养箱中取出，加入多聚甲醛固定细胞，随后用结晶紫染液染色，最后拍照计数细胞集落个数。

3.10 Transwell实验 取阴性对照、PDHA1稳定敲除、回补PDHA1成功的细胞，按每孔1×104个细胞接种于不含血清培养液的上室中，在下室中加入500 μL含10%胎牛血清培养液，放入培养箱培养16 h后，将小室取出固定染色，显微镜下进行拍照记录。

4 统计学处理

所有实验至少重复3次，采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析。数据用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。当P＜0.05时表明差异有统计学意义。

结 果

1 PDHA1在乳腺癌中高表达

通过对TCGA数据的综合分析，我们试图了解不同临床病理特征的乳腺癌组织中PDHA1的表达情况。结果显示，与癌旁组织相比，各种乳腺癌亚型中PDHA1的mRNA表达水平显著升高，其中TNBC亚型比Luminal和HER2阳性亚型表现出更明显的上调，见表2和图1A。此外，PDHA1 mRNA表达在T阶段随着肿瘤大小的增加而呈现上升趋势，而N和M肿瘤阶段之间没有观察到有统计学意义的差异，见表2和图1B。乳腺癌组织中PDHA1的mRNA表达量与ER和PR相关，但与HER2无显著相关性，见表2和图1C～E。此外，乳腺癌细胞系（MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-486和T47D）中PDHA1的mRNA表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞（MCF-10A），见图1F。

Figure 1.High expression of PDHA1 in breast cancer.A： the expression of PDHA1 in normal breast tissue and breast cancer tissue analyzed by UALCAN database；B： the expression of PDHA1 in different clinicopathological stages of breast cancer analyzed by TCGA database；C： the PDHA1 expression in ER negative or positive cases analyzed by TCGA database；D： the PDHA1 expression in PR negative or positive cases analyzed by TCGA database；E： the PDHA1 expression in HER2 negative or positive cases （n=1 226） analyzed by TCGA database；F： the expression of PDHA1 in normal breast epithelial cell line and breast cancer cell lines.Mean±SD.*P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs Luminal group；△P＜0.05， △△P＜0.01 vs T1 group；▲▲P＜0.01 vs negative group；@@P＜0.01 vs MCF-10A group.图1 PDHA1在乳腺癌中高表达

表2 乳腺癌患者PDHA1表达与临床病理特征的关系Table 2.Relationship between PDHA1 expression and clinicopathologic features in breast cancer patients

2 PDHA1在乳腺癌中高表达提示患者预后不良

免疫组织化学分析证实，与配对的癌旁组织相比，乳腺癌组织中PDHA1蛋白水平显著上调，见图2A。为阐明PDHA1对乳腺癌患者预后的影响，本研究利用KM-plotter数据库根据PDHA1的表达水平对乳腺癌患者进行生存分析，结果显示，PDHA1高表达患者的总生存期（overall survival， OS）、无远处转移生存期（distant metastasis free survival， DMSF）和无复发生存期（recurrence free survival， RFS）明显低于PDHA1低表达患者，见图2B。

Figure 2.High expression of PDHA1 in breast cancer suggestsed poor patient prognosis.A： the expression of PDHA1 in TNBC tissues and paracancerous tissues detected by immunohistochemical staining （scale bar=100 μm）；B： three different types of survival analysis of breast cancer patients with different PDHA1 expression levels in KM-plotter database.图2 PDHA1在乳腺癌中高表达提示患者预后不良

3 PDHA1敲除抑制MDA-MB-231细胞增殖

使用Western blot分析进行研究，以验证TNBC细胞系MDA-MB-231中PDHA1的稳定敲除，见图3A。随后，对稳定的PDHA1敲除MDA-MB-231细胞系和对照细胞系进行细胞计数实验和集落形成测定。结果表明，PDHA1敲除后细胞增殖减少，见图3B～D。这些结果证明PDHA1在促进MDA-MB-231细胞的增殖能力中发挥着关键作用。

Figure 3.Knockout of PDHA1 inhibited MDA-MB-231 cell proliferation.A： Western blot detection of PDHA1 knockout effect in MDA-MB-231 cells；B： cell counting method to detect the proliferation ability of MDA-MB-231 cells after knockout of PDHA1；C： clone formation assay to detect the proliferation ability of MDA-MB-231 cells after PDHA1 knockout.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs parental group.图3 敲除PDHA1抑制MDA-MB-231细胞增殖

4 PDHA1敲除抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭

为了研究PDHA1对细胞迁移和侵袭的影响，使用野生型、稳定PDHA1敲除和PDHA1回补3种MDA-MB-231细胞系进行划痕实验。结果显示，PDHA1敲除明显抑制细胞迁移，并且这种效应可以通过PDHA1回补来挽救，见图4A、B。使用相同的细胞系进行后续Transwell测定以评估迁移能力。稳定敲除PDHA1可以抑制MDA-MB-231细胞的迁移潜力，而PDHA1回补恢复其迁移能力，见图4C、D。进一步的探索涉及针对上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition， EMT）途径标志物的蛋白质印迹实验。结果表明，相对于对照组，MDA-MB-231细胞中稳定的PDHA1敲除导致E-cadherin蛋白水平升高，而N-cadherin和vimentin蛋白没有表现出统计学意义上的显著变化，表明PDHA1促进MDA-MB-231细胞的EMT，见图4E、F。总之，PDHA1促进MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。

Figure 4.Knockout of PDHA1 inhibited the migration and invasion of MDA-MB-231 cells.A： scratch experiment to detect the migration ability of three MDA-MB-231 cell lines： wild-type， stable knockout of PDHA1， and complement of PDHA1 （scale bar=400 μm）；B： Transwell experiment was performed to detect the invasion ability of three MDA-MB-231 cell lines： wildtype， stable knockout of PDHA1， and complementation of PDHA1 （scale bar=400 μm）；C： Western blot experiment and related gray value analysis for marker proteins of the epithelial-mesenchymal transition pathway.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs vector+parental group；△△P＜0.01 vs parental group.图4 PDHA1敲除抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭

5 PDHA1在乳腺癌中的相互作用蛋白

为进一步阐明PDHA1促进乳腺癌进展的分子机制，我们使用String数据库进行分析，以预测PDHA1的相互作用蛋白并利用在线工具仙桃学术对分析结果作图。该结果揭示了涉及PDHA1及其相互作用蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络，表明PDHA1与核糖核酸酶P/MRP蛋白亚基（ribonuclease P/MRP protein subunit， POP1）、支链氨基酸转氨酶2（branched chain amino acid transaminase 2， BCAT2）、二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移酶（dihydrolipoamideSsuccinyltransferase， DLST）等之间存在潜在的相互作用，见图5。该网络的形成意味着涉及这些蛋白质的蛋白质复合物可能影响乳腺癌的发生和发展。

Figure 5.Visualization of PHDA1 protein and its interacting proteins using String database.图5 PHDA1蛋白及其互作蛋白可视化网络

6 预测PDHA1在乳腺癌中的相互作用蛋白及通路

分析相对正常乳腺组织，乳腺癌中PDHA1高表达组和PDHA1低表达组之间共表达基因的差异。我们在高PDHA1表达组中相对于低PDHA1表达组确定了2 143个上调基因和1 422个下调基因（|log2FC|≥1，P＜0.05），见图6A。为研究与PDHA1相关的差异表达基因的功能意义，对3 565个差异表达基因进行了GO和KEGG分析。结果表明PDHA1可能通过与生长发育的途径调节乳腺癌的发生发展，见图6B～E。

Figure 6.Compared with normal breast tissue， GO annotation and KEGG pathway analysis of differentially expressed genes between high PDHA1 expression and low PDHA1 expression groups in breast cancer tissue.图6 相对于正常乳腺组织，在乳腺癌组织中PDHA1高表达与PDHA1低表达组间差异表达基因的GO注释和KEGG通路分析

为了明确PDHA1表达差异对肿瘤细胞信号通路的调控作用，我们以PDHA1表达的中位数为切点，将乳腺癌患者分为高表达PDHA1组和低表达PDHA1组，并进行组间差异基因分析。相较于低表达PDHA1组，高表达PDHA1组显示出6 188个差异基因，其中上调的有1 110个，下调的有5 078个（图7）。将GO注释和KEGG通路分析的前10个结果绘制图形，结果显示，PDHA1失调可能影响细胞代谢进程，从而调控乳腺癌的发生发展，见图7。

Figure 7.In breast cancer tissue， volcano plot， KEGG analysis and GO annotation of differentially expressed genes between PDHA1 high expression and PDHA1 low expression groups.图7 在乳腺癌组织中，PDHA1高表达与PDHA1低表达组间差异表达基因火山图及KEGG分析和GO注释

讨 论

肿瘤代谢重编程是促使恶性肿瘤发生发展的标志，而有氧糖酵解也是肿瘤细胞重要的代谢特征［23-24］。PDHA1是线粒体中确定糖酵解通路和三羧酸循环通路平衡的枢纽，在决定肿瘤代谢模式的转换以及发生发展发挥着重要作用。TNBC缺乏明确的驱动基因，目前还没有效果良好的靶向治疗方案，而TNBC具有显著的代谢紊乱，因此，我们对PDHA1在TNBC中的表达及影响进行了探讨。

通过检索TCGA数据库，根据PDHA1的表达水平对乳腺癌患者进行生存分析，结果显示PDHA1高表达与乳腺癌患者总生存期呈负相关，PDHA1在具有不同临床病理特征乳腺癌组织中的表达，mRNA水平在不同乳腺癌亚型中明显升高，在肿瘤T分期中随着肿瘤大小的增加有上调的趋势。临床样本免疫组化结果显示，相对于癌旁组织，乳腺癌组织中的PDHA1表达水平显著升高，提示PDHA1高表达会促进乳腺癌的发展，与生存分析结果趋势一致。体外细胞实验显示，在稳定敲除PDHA1的TNBC细胞系MDA-MB-231中，细胞增殖、集落形成、迁移能力和EMT均明显减弱，提示PDHA1的高表达与TNBC的发生发展以及远端转移密切相关。与之类似的是肺腺癌PDHA1的高表达与不良的总生存期相关，而胃腺癌患者中低表达PDHA1提示有良好的预后［25］。为了进一步验证TNBC中高表达 PDHA1与肿瘤细胞增殖、迁移的关系，我们构建了稳定敲除PDHA1的MDA-MB-231细胞，检测到敲除PDHA1后会抑制细胞迁移、侵袭能力，在稳定回补外源性表达的PDHA1后恢复了促进细胞迁移和侵袭能力，进一步说明PDHA1在TNBC增殖、转移过程中具有重要作用。转移是许多恶性肿瘤死亡率增加的主要原因，其中，EMT途径是促进肿瘤迁移和侵袭的关键驱动因素［26-30］。乳腺癌具有显著异质性，因此EMT通路中关键标志物表达水平的变化可作为指示性指标，为了解乳腺癌迁移和侵袭能力的动态变化提供见解［31-33］。认识到EMT在转移级联反应中的关键作用，为探索PDHA1对乳腺癌侵袭行为的潜在干预提供了宝贵的视角。为进一步探索PDHA1促进TNBC迁移的分子机制，我们检测了EMT通路相关蛋白，结果显示敲除PDHA1后E-cadherin蛋白量明显上调，提示PDHA1促进TNBC的转移。之前的研究表明，翻译后修饰在调控PDHA1功能上起着重要的作用。酪氨酸激酶FGFR1在Y243、244位点和Y136位点磷酸化PDHK，激活其活性，从而进一步磷酸化PDHA1的S293位点，抑制PDHA1转换丙酮酸的能力，促进肺癌细胞增殖和肿瘤生长。丙酮酸脱氢酶磷酸酶PDP1在Y381位点磷酸化修饰后脱离去乙酰化酶SIRT3、招募乙酰转移酶ACAT1，进一步乙酰化PDHA1和PDP1，促进PDK对PDHA的抑制性磷酸化，促进有氧糖酵解和肿瘤细胞增殖［15］。此外，在TNBC细胞中，干扰PDHA1能够导致TNBC肿瘤转移能力下降和对葡萄糖缺乏引起的代谢压力的不耐受，AMPK通过调节丙酮酸脱氢酶复合体的活性从而调控三羧酸循环水平促进TNBC转移［34］。但是，PDHA1蛋白本身如何促进TNBC转移还不清楚。为了进一步探索PDHA1促进TNBC增殖和转移的机制，我们采用生物信息学方法来鉴定PDHA1在乳腺癌中潜在的过度表达，其可能与POP1、BCAT2和DLST形成蛋白复合物。乳腺癌中POP1的表达升高可促进细胞增殖和迁移，同时抑制细胞凋亡［35-37］。DLST（一种三羧酸循环酶）的耗尽会抑制人类TNBC细胞系的生长并诱导细胞凋亡［38-40］。与正常乳腺组织相比，乳腺癌组织中POP1、BCAT2和DLST的高表达水平与不良预后相关［35-41］，协同促进乳腺癌的发生和发展。使用GO和KEGG通路的差异表达基因分析表明，PDHA1的上调可以刺激与生长发育或细胞代谢相关的通路，从而促进乳腺癌的增殖和转移。然而，PDHA1是否通过与上述蛋白的相互作用来促进TNBC细胞的增殖和迁移有待后续研究进一步探讨。