Uhrf1基因重组腺病毒载体构建及其在小鼠心肌细胞DNA损伤修复中的作用研究*

江 南， 王驰寅， 聂 宇， 王 珏，2△

（1温州医科大学第一临床医学院，浙江 温州 325000；2温州医科大学附属第一医院心脏外科，浙江 温州 325000；3中国医学科学院，北京协和医学院国家心血管病中心，阜外医院心血管疾病国家重点实验室，北京 100037）

泛素样同源域和环指结构域1（ubiquitin-like with plant homeodomain and RING finger domains 1，Uhrf1），也称为NP95或ICBP90，是一种多结构域蛋白，包含泛素样结构域（ubiquitin-like domain， UBL）、串联铎域（tandem tudor domain， TTD）、植物同源结构域（plant homeodomain， PHD）、SET和RING相关结构域（SET and RING-associated domain， SRA）以及真正有趣的新基因结构域（really interesting new gene domain， RING）。这些结构域经过连接区进行翻译后修饰，调控UHRF1不同的空间构象状态，影响其稳定性和功能［1］。研究表明，Uhrf1基因在DNA甲基化、DNA损伤修复和细胞增殖中扮演着关键角色［2-4］。Muto等［5］的研究指出，UHRF1的缺失可提高细胞对DNA损伤剂的敏感性，最初被发现参与DNA损伤修复的染色质标志是磷酸化组蛋白H2A变异体（γ histone H2A，γH2AX）［6］，而Tian等［2］观察到，缺乏UHRF1功能的细胞会积累DNA损伤标志物γH2AX。然而，当前研究对Uhrf1基因在心肌细胞中发挥何种作用知之甚少，因心肌细胞质粒转染效率极低，严重制约了相关研究的进展。因此，本研究旨在构建并鉴定小鼠Uhrf1基因重组过表达腺病毒载体，为进一步利用腺病毒基因递送系统在心肌细胞中实现Uhrf1基因过表达，探索Uhrf1基因在心肌细胞DNA损伤中的作用提供实验依据。

材料和方法

1 动物

SPF级ICR小鼠，1日龄，0.8～1.2 g，共25只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0004。

2 主要实验试剂

限制性内切酶AsisI及MluI、质粒载体pADMCMV-C-FH、T4 DNA连接酶、感受态细胞DH5α和PrimeScript RT Master Mix （RR036A）购自TaKaRa；DMEM培养液及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco；青霉素/链霉素溶液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）及RIPA裂 解 液（P0013B）购于上海碧云天生物技术有限公司；4%～12% Bis-Tris预制胶、蛋白质电泳缓冲液、蛋白质转膜缓冲液、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜、驴抗鼠488 Ⅱ抗（A-21202）、驴抗兔594 Ⅱ（A-21207）、山羊抗鼠HRP Ⅱ抗（31430）及山羊抗兔HRP Ⅱ抗（31460）购自Invitrogen；DMSO购自北京索莱宝科技有限公司；腺病毒感染性滴度快速测定试剂盒LABKIT®AD-010（24Tests）购自深圳莱伯克生物科技有限公司；新生小鼠心脏解离试剂盒（130-098-373）购自MiltenyiBiotec；UHRF1抗体（sc-373750）购自Santa Cruz；Phospho-H2AX（γH2AX）抗体（9718S）、H2AX抗体（2595S）、Bax抗体（5023S）、Bcl-2抗体（4223S）及α-Tubulin抗体（2144S）购自Cell Signaling Technology；重 组 Anti-cardiac troponin T（CT3）（ab209813）购自Abcam；含DAPI的封片剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

3 主要方法

3.1 含有鼠源Uhrf1基因序列片段的合成 从原代小鼠心肌细胞中提取总RNA，总RNA反转录后得到cDNA。根据NCBI GenBank中小鼠Uhrf1基因编码序列（NM_001111078.1）设计含有酶切位点的引物，上游引物序列为5’-GCGATCGATGTGGATCCAGGTTCGAAC-3’，下 游 引 物 序 列 为5’-GACGCGTTCACCGGCCGCTGCCATAGC-3’。进行PCR扩增后得到Uhrf1基因片段，经AsisI/MluI双酶切后回收，酶切体系为：基因片段20 μL（约2 μg），10×缓冲液5 μL，ddH2O 24 μL，AsisI 0.5 μL，MluI 0.5 μL，总体系50 μL。37 ℃反应3 h。

3.2 质粒载体pADM-CMV-C-FH酶切 用AsisI和MluI双酶切质粒载体pADM-CMV-C-FH，将合成的Uhrf1基因片段连接至酶切后的质粒载体pADMCMV-C-FH中。酶切体系为质粒DNA 20 μL（约2 μg），10×缓冲液 5 μL，ddH2O 24 μL，AsisI 0.5 μL，MluI 0.5 μL，总体系50 μL。37 ℃反应3 h。

3.3 目的基因片段和质粒载体pADM-CMV-C-FH的连接鉴定 取上述酶切回收后的Uhrf1基因片段及质粒载体进行连接反应，连接体系如下：DNA片段6 μL，pADM-CMV-C-FH 1 μL，T4 DNA连接酶2 μL，DNA连接酶缓冲液1 μL。16 ℃转化到感受态细胞DH5α，挑取单克隆菌落过夜培养后提取质粒，利用AsisI和MluI双酶切鉴定，1 %琼脂糖凝胶电泳检测验证片段长度。

3.4 基因测序 重组质粒由山东维真生物科技有限公司进行测序验证序列信息。

3.5 重组腺病毒pADM-CMV-C-FH-UHRF1包装、扩增及纯化 将重组腺病毒转染至HEK293T细胞中，放置于CO2细胞培养箱中培养。观察大部分细胞出现细胞病变效应后，收集细胞，采用1 000 × g离心7 min后，留细胞沉淀和约5 mL上清液，充分溶解。将细胞悬液于干冰与37 ℃恒温器反复冻融4次，12 000 ×g离心2 min。收集病毒上清液，放置于-80 ℃冰箱中保存。重复上述步骤，可以达到病毒扩增的目的。使用碘克沙醇密度梯度离心法对病毒进行纯化，得到高滴度的病毒浓缩液。

3.6 ADM-Uhrf1腺病毒滴度测定 根据腺病毒感染性滴度快速测定试剂盒说明，分为9个梯度稀释病毒样品后感染细胞，37 ℃培养48 h。甲醇固定10 min后洗涤，先后加入Ⅰ抗稀释液和Ⅱ抗稀释液37 ℃孵育1 h。加入配制的3，3′-二氨基联苯胺（3，3'-diamino-benzidine，DAB）工作液显色30 min，用显微镜对阳性细胞进行计数。数出倒数两孔的阳性细胞数，根据腺病毒滴度计算公式：病毒滴度（pfu/mL）=（倒数第二孔阳性细胞+倒数第一孔阳性细胞×10）×1 000/2/倒数第二孔病毒量（μL），计算ADMUhrf1腺病毒滴度。

3.7 分离原代心肌细胞并加入重组腺病毒转染配制心肌细胞解离酶，每个C管包含62.5 μL酶P，12.5 μL酶A，100 μL酶D，2 300 μL缓冲液X和25 μL缓冲液Y。在超净台中使用眼科剪正中切口刺入小鼠胸口，挤出并用镊子摘下心脏，放入PBS中剪去心耳，将心脏放入C管后放置gentleMACS消化1 h，加入含10 %FBS的培养液终止消化，300 × g离心5 min后弃去上清，加入2 mL红细胞裂解液裂解2 min，加入PBS清洗，再次300 ×g离心5 min后弃去上清，加入10 mL培养液吹打重悬细胞，利用差速贴壁法收集心肌细胞种板。待种板20 h后，使用不加FBS的DMEM培养液饥饿4 h，加入Uhrf1过表达腺病毒（MOI=50），培养20 h。

3.8 心肌细胞免疫荧光染色 加入4%多聚甲醛固定心肌细胞15 min后PBS洗3次，每次5 min。将适量Triton-X 100加入到5%驴血清封闭液中制成0.3%～0.5%封闭通透液，室温孵育1 h后洗涤。4 ℃过夜孵育UHRF1抗体及CT3抗体，次日复温30 min后再次洗涤。避光室温孵育相应种属Ⅱ抗1 h，洗涤后加入含DAPI的封片剂于共聚焦显微镜拍摄。

3.9 H2O2细诱导胞氧化损伤模型制备 将其余加入Uhrf1过表达腺病毒组的细胞随机均分为两组，其中一组更换含有200 μmol/L H2O2的DMEM培养液，另一组更换普通DMEM培养液。对照病毒组进行相同处理，培养2 h后收样。

3.10 提取原代心肌细胞蛋白 饥饿4 h后将其余细胞更换为含有200 μmol/L H2O2的DMEM培养液培养2 h后收样。加入RIPA裂解液，刮下贴壁细胞充分裂解，收集细胞及裂解液至EP管，20 000 ×g离心15 min，取上清液BCA法测浓度，调整至一致浓度后上样行Western blot，孵育UHRF1抗体、γH2AX抗体、H2AX抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体及α-Tubulin抗体验证腺病毒过表达水平并研究DNA损伤程度。

4 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.5软件分析数据。所有数据用均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间比较采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计学分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 重组质粒pADM-CMV-C-FH的验证

质粒pADM-CMV-C-FH图谱及酶切位点见图1。经酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳显示两条带，一条为2 kb左右，一条为4 kb 左右，证明重组质粒获得长约2 349 bp的插入片段（即目的基因Uhrf1），见图2。

Figure 1.Plasmid pADM-CMV-C-FH map and restriction enzyme cleavage sites.图1 质粒pADM-CMV-C-FH图谱及酶切位点

Figure 2.The electrophoretic analysis of DNA fragments after enzymatic digestion on an agarose gel.图2 酶切产物DNA片段琼脂糖凝胶电泳检测分析

2 重组腺病毒ADM-Uhrf1感染细胞观察及病毒滴度测定

根据两组阳性细胞梯度图（图3），最终计算得出ADM-Uhrf1病毒滴度为1.8×1013pfu/L。

Figure 3.DAB staining of gradient dilution viral sample.A：DAB-positive cells at a viral dilution of 10-6 μL；B：DAB-positive cells at a viral dilution of 10-7 μL.图3 梯度稀释病毒样品的DAB染色

3 UHRF1在心肌细胞中的免疫荧光染色表达水平

免疫荧光染色检测UHRF1在心肌细胞中表达情况显示，与ad-Ctrl组相比，ad-Uhrf1组UHRF1表达水平显著增加，且其表达主要位于心肌细胞核内，见图4。

Figure 4.Representative immunofluorescence images of cardiomyocytes from the ad-Ctrl group and the ad-Uhrf1 group were presented， showing various channels and merged images.Monochromatic channel images depicted Uhrf1， cardiac troponin T （cTnT） and DAPI.The merged images combined the information from all three channels.图4 新生小鼠原代心肌细胞免疫荧光染色各通道代表图

4 过表达Uhrf1减轻心肌细胞DNA损伤而不影响细胞凋亡

Western blot分析结果显示，无论H2O2处理与否，与ad-Ctrl组相比，ad-Uhrf1组的UHRF1蛋白表达水平均呈现显著上调（P＜0.05）。H2AX和DNA损伤的标志物γH2AX（Ser139）的蛋白表达水平在不经H2O2处理的情况下未观察到显著差异，而在H2O2处理情况下，ad-Uhrf1组的γH2AX蛋白表达水平相比ad-Ctrl组显著下调（P＜0.01）。此外，在各组中均未检测到Bax和Bcl-2等细胞凋亡蛋白表达水平的改变，见图5。

Figure 5.Impact of Uhrf1 overexpression on H2O2-induced oxidative injury in cardiomyocytes.The protein expression levels of Uhrf1，γH2AX， H2AX， Bax， Bcl-2 and α-tubulin upon hydrogen peroxide treatment and Uhrf1 overexpression were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs ad-Ctrl group.图5 过表达Uhrf1对心肌细胞H2O2氧化损伤模型的影响

讨 论

作为全身血液循环系统的核心器官，心脏在代谢过程中以及发生缺血再灌注损伤后会产生大量的活性氧，包括但不限于H2O2和自由基，这些活性氧物质过量积聚可能引发心肌细胞膜脂质的过氧化、DNA的损伤以及蛋白质的氧化，直接影响心肌细胞的功能和整体心脏健康。近年来，Uhrf1作为维持DNA甲基化的基本表观遗传学调节因子一直受到广泛关注［7］，除了在复制过程中起到维持DNA甲基化的重要作用外，Uhrf1在DNA损伤修复方面同样扮演着关键的协同角色。鉴于腺病毒过表达的直接特性［8］，本实验成功构建了携带Uhrf1基因的重组腺病毒载体的实验模型，并确认了其滴度［9］，在实现体外心肌细胞Uhrf1特异性过表达的前提下进一步研究了其对H2O2诱导的DNA损伤的影响。

实验结果表明，与对照组相比，心肌细胞过表达Uhrf1组的γH2AX蛋白表达水平显著降低，而H2AX蛋白的总表达水平并未发生变化，这表明过表达Uhrf1能够减轻H2O2引发的心肌细胞DNA氧化损伤。这一结果与先前的研究结果一致，即SRA和RING结构域在与受损DNA结合以及募集DNA修复相互作用因子方面发挥作用，使得DNA修复机制能够迅速检查、修复和替换受损DNA上的错误遗传信息，从而保障DNA在遗传过程中的准确性［10-11］。

此外，有研究报道H2O2能够诱导细胞凋亡［12］，我们检测了细胞凋亡通路相关蛋白Bax及Bcl-2的表达水平，但过表达Uhrf1并未改变其表达水平，这表明UHRF1可能不通过抗凋亡通路促进心肌细胞应对DNA损伤的反应能力［13］。综合考虑到Uhrf1在细胞增殖［14］、DNA甲基化［7］及调控AMPK能量代谢方面的作用［15-16］，这提示UHRF1可能通过DNA甲基化或其他结构域的功能来抵抗心肌细胞受到的DNA损伤，抑或是心肌细胞本身可能通过某种机制来对抗细胞凋亡，以应对日常产生的大量活性氧的损伤。然而，需要进一步的实验研究来探索Uhrf1基因在抵抗心肌细胞死亡中的确切作用机制。

总之，本研究通过利用腺病毒载体构建技术建立了体外心肌细胞H2O2氧化损伤模型，为深入了解与氧化损伤相关的心血管疾病提供了实验基础。