hsa-miR-204-5p对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响*

张义炜， 杨 英， 潘尚领

（广西医科大学基础医学院病理生理学教研室，广西 南宁 530021）

血管内皮细胞在循环系统的发育和维持中起着关键作用［1］，其功能的障碍是冠状动脉粥样硬化发生的基础［2］，而后者引发的冠心病（coronary heart disease， CHD）是近代以来人类最主要的死亡原因［3-4］。因此，明确内皮细胞功能障碍的机制，有助于CHD的防治，提高人类寿命。已知吸烟、熬夜等不良生活方式及高血压、糖尿病、高血脂、肥胖等基础病是血管内皮细胞损伤的重要因素，损伤所致的内皮细胞黏附因子/趋化因子表达、泡沫细胞的聚集、血脂的沉积、内皮细胞的异常增殖和凋亡［5-8］，是CHD发生发展的主要过程及机制，但具体的细节及信号转导通路尚未明了。近年，高通量测序技术的进步及生物信息学的发展，让人们对非编码RNA的功能有了新的认识，它们在内皮细胞稳态失调中的作用逐渐被揭示。

微小RNA（microRNA， miRNA）是一类非编码小RNA，其主要作用方式是通过靶向结合mRNA的3’UTR区抑制靶基因的翻译或促进mRNA的降解［9］。新近有报道表明，miRNA参与调节血管生成的过程［10］，而且已发现多种miRNA作为CHD的生物标志物参与CHD的发生发展。例如miR-320b通过促进p65磷酸化水平来提升促炎细胞因子水平，进而促进动脉粥样硬化［11］；miR-27a和miR-329表达水平的增加可能通过下调ABCA1和ABCG1基因的表达促进动脉粥样硬化斑块的进展［12］；miR-15b-5p通过抑制mTOR信号通路抑制CHD［13］。

hsa-miR-204-5p（以下简称miR-204-5p）在多个领域已被研究，其中作为肿瘤抑制因子的报道最为广泛，例如miR-204-5p可抑制甲状腺癌［14］和胃癌［15］的发生发展，其大概机制是抑制肿瘤细胞的增殖和迁移、促进肿瘤细胞的凋亡。而CHD的发生是内皮细胞的异常增殖和凋亡所致，因此，我们推测，miR-204-5p有可能会影响内皮细胞的功能状态，故本研究的主要目的是进一步了解miR-204-5p对内皮细胞迁移、增殖、周期及凋亡的影响，为防治CHD提供新的参考资料。

材料和方法

1 实验材料

人脐静脉内皮细胞株EA.hy926购自中科院上海细胞库。

2 主要试剂

胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购自上海逍鹏生物科技有限公司；DMEM培养液购自GIBCO；LipoFiter 3.0脂质体转染试剂购自上海汉恒生物科技有限公司；miR-204-5p mimics和mimics阴性对照（mimics-negative control， mimics-NC）购自苏州吉玛基因有限公司。hsa-miR-204-5p mimics的正义链序列为5'-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3'，反义链序列为5'-GCAUAGGAUGACAAAGGGAAUU-3'；mimics-NC的正义链序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反义链序列为5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。SanPrep Column microRNA Extraction Kit和miRNA第一链cDNA合成（加尾法）试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline， PBS）购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶细胞消化液购自上海生工生物工程股份有限公司；细胞周期试剂盒和细胞凋亡试剂盒（Annexin V-APC/7AAD）均由杭州联科生物技术股份有限公司提供；75%乙醇溶液购自广西博亨医疗用品有限公司；过氧化氢（H2O2）溶液购自Sigma；AxyPrepTm Multisource Total RNA Miniprep Kit购自杭州AXYGEN 生物技术有限公司；RNA文库制备及测序由上海天昊生物科技有限公司完成。

3 主要方法

3.1 细胞转染 选择EA.hy926细胞用于分析miR-204-5p对细胞功能的影响［16］。培养基为含10% FBS的DMEM。将细胞放在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。所有操作均在超净台内进行，操作前紫外线照射30 min以上。将EA.hy926细胞接种于六孔板中，每孔4×105个细胞，待细胞汇合度达到80%左右，利用LipoFiter 3.0脂质体转染试剂转染miR-204-5p mimics和mimics-NC。转染步骤以LipoFiter 3.0脂质体转染试剂说明书为准。转染30 h左右，利用San-Prep Column microRNA Extraction Kit提取细胞miRNA，并使用miRNA第一链cDNA合成（加尾法）试剂盒将miRNA逆转录成cDNA。利用RT-qPCR测定转染效率并进行后续的细胞功能实验。RT-qPCR条件如下：95 ℃预变性600 s；随后在95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s条件下进行40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s后得到熔解曲线，最后50 ℃ 30 s进行降温。miR-204-5p转染效率测定公式为2-ΔΔCt［ΔΔCt=（CtmiR-204-5pmimics-CtmiR-204-5pmimicsU6）-（Ctmimics-NCCtmimics-NCU6）］。

3.2 细胞活力实验 收集转染了miR-204-5p mimics和mimics-NC的EA.hy926细胞，调整细胞悬液浓度为4×107/L，取一96孔板，每孔加100 μL，使细胞数为每孔4 000个。每孔加10 μL CCK-8试剂，放置于细胞培养箱孵育1 h。最后，使用酶标仪分别于0、24、48、72和96 h测量细胞在450 nm处的吸光度。

3.3 细胞划痕实验 转染miR-204-5p mimics和

mimics-NC入EA.hy926细胞30 h后，用PBS洗涤一次细胞。利用1 000 μL枪头按十字线进行划痕，然后再次使用PBS洗涤两次细胞，分别于0、12、24和36 h在倒置显微镜4倍目镜/10倍物镜下拍照。利用ImageJ软件分析划痕面积。

3.4 细胞迁移实验 通过Tranwell实验进一步研究miR-204-5p对EA.hy926细胞迁移能力的影响。使用胰蛋白酶细胞消化液消化细胞。利用含2% FBS的DMEM重悬细胞，使细胞浓度为2×108/L，充分混匀后吸取100 μL细胞悬液种于小室中，将小室浸于装有500 μL含3% FBS的DMEM的24孔板内，24 h后，将小室取出，使用PBS洗涤3次后，利用甲醇固定30 min。最后，对小室外侧细胞进行结晶紫染色，8～12 h后，使用PBS洗涤3次小室，晾干后于倒置显微镜下拍照。

3.5 细胞周期实验 收集至少1×106个细胞到10 mL管中，1 000 rpm离心5 min。弃去上清液，向每管中加入1 mL预冷的PBS清洗3次，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入1 mL PBS重悬细胞，随后，使用200 μL枪头吸取细胞悬液，逐滴加入到3 mL预冷的75%乙醇溶液中，边加边震荡，-20 ℃避光固定过夜；次日，将细胞拿出，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，向每管中加入5 mL PBS清洗一次，放置15 min后1 000 r/min离心5 min；弃去上清，每个样本中加入1 mL DNA staining solution，室温下避光孵育30 min，随后使用流式细胞仪检测细胞周期。

3.6 细胞凋亡实验 首先，利用不同浓度H2O2溶液构建细胞凋亡模型，浓度梯度依次为200、400、600、800、1 000和1 200 μmol/L。使用最佳浓度H2O2溶液和转染了miR-204-5p mimics和mimics-NC的926细胞共培养24 h后，至少收集1×106个细胞，1 000 r/min离心5 min；弃去上清液，每管加入1 mL PBS，洗涤3次。留取细胞沉淀，加入500 μL 1× Binding Buffer重悬细胞，随后每管加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7AAD，轻轻震荡混匀后，室温避光孵育15 min，利用流式细胞仪（BD FACSC Calibur）检测细胞凋亡率。

3.7 RNA-seq 使 用AxyPrepTm Multisource Total RNA Miniprep Kit提取细胞总RNA，确保RNA总量＞2 μg，浓度≥100 mg/L，A260/A230≥2.0，A260/A280在1.8～2.2之间，且Agilent 2100 Bioanalyzer检测的RIN≥6.5。以美国Illumina生物技术公司的样品制备试剂盒说明书为准构建cDNA文库。构建完成后，应用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒纯化文库的同时进行片段大小筛选。使用Qubit和Agilent 2100 Bioanalyzer分别检测文库浓度与文库片段长度分布。要求浓度＞5 mg/L，且片段长度集中在300～400 bp之间。文库最终以2×150 bp双端测序模式在Illumina高通量测序平台进行高通量测序并获得FastQ数据。采用FastQC软件及R version 4.2.1对原始测序数据进行质量评估。使用STAR软件将过滤后的reads与参照数据库进行比对，比对上的碱基所占比例在一定程度上能反映测序水平的高低、所选参考基因组的优劣以及后期分析水平的可靠程度。利用Stringtie的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量。采用Deseq2软件分析差异表达基因。筛选条件为P＜0.05且|log2（fold change）|＞0.5。

3.8 富集分析 利用miRWalk查找miR-204-5p的下游靶基因，结合位点选择3'UTR，和RNA-seq得到的下调基因取交集，随后进行基因本体论（Gene Ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。通过美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information， NCBI）设计基因引物并使用RT-qPCR对富集在MAPK通路里的MAPT、PPP3R1、PRKACB、PTPRR、MAP2K4、CACNA2D2和RPS6KA6进行验证。以GAPDH作为内参照。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1.Primer sequences of the genes

4 统计学处理

涉及两组之间的比较，若数据符合正态分布，则使用独立样本t检验，否则使用曼惠特尼检验。SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0被用来分析数据和作图，数据以均数±标准差（mean±SD）表示。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

结 果

1 过表达miR-204-5p抑制EA.hy926细胞的活力和迁移

RT-qPCR检测结果显示，miR-204-5p mimics组EA.hy926细胞miR-204-5p的表达效率是对照组的2 149倍，表明转染成功，可以进行下一步实验。CCK-8实验用于探究miR-204-5p对EA.hy926细胞活力的影响，结果发现，miR-204-5p mimics在第24及48小时抑制EA.hy926细胞的活力；Transwell实验表明miR-204-5p mimics可以显著抑制EA.hy926细胞的迁移能力，见图1。

Figure 1.Results of CCK-8 and Transwell experiments.A： CCK-8 assay showing the viability of EA.hy926 cells in mimics-NC and miR-204-5p mimics groups at 0， 24， 48， 72 and 96 h；B： Transwell assay displaying the number of migrating cells with mimics-NC and miR-204-5p mimics under an inverted microscope（×100）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs mimics-NC group.图1 CCK-8和Transwell实验结果

细胞划痕结果显示，相对于mimics-NC，miR-204-5p mimics可以在12 h和24 h抑制EA.hy926细胞的愈合能力，见图2。

2 过表达miR-204-5p使S期细胞减少并抑制细胞凋亡

过表达miR-204-5p使G0/G1期细胞数目增多，使S期细胞数减少（P＜0.05），见图3A。使用不同浓度H2O2构建细胞凋亡模型，结果发现1 000 μmo/L的浓度可以在不过度损伤细胞的前提下使细胞凋亡率有较高提升，因此，选择1 000 μmo/L浓度的H2O2构建细胞凋亡模型。细胞凋亡率分析发现，miR-204-5p mimics显著降低了EA.hy926细胞的早期凋亡率（P＜0.05），见图3B。

Figure 3.Results of the cell cycle and apoptosis assays.A： the proportion of EA.hy926 cells in G0/G1， S and G2/M phases；B： the early and late apoptosis rates of EA.hy926 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mimics-NC group.图3 细胞周期和细胞凋亡检测结果

3 富集分析

RNA-seq结果显示，过表达miR-204-5p后，以P＜0.05且log2FC≤-0.5为条件，共有432个基因表达下调，和miRWalk预测的下游靶基因取交集后，共得到138个可能的下游靶基因。将下游靶基因导入metascape进行GO/KEGG富集分析，发现在生物学过程（biological process，BP）中，下游靶基因主要富集在蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）、小蛋白偶联修饰蛋白（protein modification by small protein conjugation）和蛋白质分解代谢过程（protein catabolic process），见图4A；在细胞组分（cellular components，CC）中，主要富集在轴突（axon）、主轴（spindle）和细胞导端（cell leading edge），见图4B；在分子功能（molecular function， MF）中，下游靶基因主要富集在酰基转移酶活性（acyltransferase activity）、激酶活性（kinase activity）和泛素样蛋白转移酶活性（ubiquitinlike protein transferase activity），见图4C。KEGG通路富集分析显示下游靶基因主要富集在单纯疱疹病毒感染（herpes simplex virus 1 infection）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）和人类T细胞白血病病毒1型感染（human T-cell leukemia virus 1 infection），见图4D。

Figure 4.Enrichment analysis of downstream target genes of miR-204-5p.A： biological process；B： cellular component；C： molecular function；D： KEGG.图4 miR-204-5p下游靶基因富集分析

4 miR-204-5p可能通过抑制MAPT的表达来抑制CHD的发生发展

通过富集分析可知，富集在MAPK信号通路里的 基 因 为MAPT、PPP3R1、PRKACB、PTPRR、MAP2K4、CACNA2D2和RPS6KA6。RT-qPCR结果显示，过表达miR-204-5p后，MAPT和MAP2K4扩增结果较好且表达下降，其中MAPT表达下降最明显，其表达量约为对照组的30%，见图5。因此，miR-204-5p可能通过抑制MAPT/MAPK信号通路而抑制内皮细胞的活力和迁移，减少细胞凋亡，进而减缓CHD的发生发展。

Figure 5.Results of RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs mimics-NC group.图5 RT-qPCR结果

讨 论

已有研究显示，lncRNA uc003pxg.1可以促进内皮细胞的增殖、迁移进而促进CHD的发生［17］。SIRT1被认为可通过抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡来抑制CHD［18］。在冠心病PBLs中高表达的miR-323-3p会导致血管内皮细胞凋亡率上升进而促进CHD发病进程［19］。以上结果证明，内皮细胞增殖、迁移增强，凋亡率上升均可以促进CHD的发生，而我们的研究结果发现过表达miR-204-5p可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并降低其凋亡率。因此，推测miR-204-5p可能通过影响内皮细胞功能而抑制CHD的发生发展。

真核生物细胞周期主要包括G1、S、G2、M四个时期，同时，细胞也可以退出细胞周期进入静止状态（G0期）［20］。其中，S期又称为DNA合成期，M期包括有丝分裂和细胞质分裂，有丝分裂和S期之间的间隔称为G1期，S期和M期之间的间隔称为G2期［21］。S期是细胞增殖的关键时期，DNA数量在此期增加一倍［22］。本研究中，过表达miR-204-5p后，发现处于S期的细胞减少，说明miR-204-5p对于内皮细胞的生长和增殖具有抑制作用。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）信号通路在细胞增殖、凋亡和分化中发挥着重要的作用［23］。目前已发现MAPK信号通路可以促进多种癌症的发生发展，例如肝癌［24］、肺癌［25］和乳腺癌［26］等。MAPK信号通路可以促进内皮细胞的增殖和迁移，并诱导细胞从细胞周期的G1期向S/G2期转变［27］。已有研究表明MAPK信号通路的激活可以促进内皮细胞的凋亡和损伤从而促进CHD的发展［28］。MAPK信号通路可以促进巨噬细胞的凋亡［29］和M1极化［30］来促进动脉粥样硬化，也可以促进炎症的发生［31］。通过富集分析，我们发现miR-204-5p下游靶基因富集在MAPK信号通路，因此推测miR-204-5p可能通过抑制MAPK信号通路进而抑制内皮细胞的迁移、增殖和凋亡，并使S期细胞减少。

综上所述，miR-204-5p可能通过抑制MAPT/MAPK信号通路进而抑制内皮细胞的活力、迁移和凋亡，这些内皮细胞生物学行为的改变可能对CHD的发生发展产生重要的影响，潜在的影响及其机制值得进一步研究。