双氢青蒿素通过激活氯通道促进鼻咽癌CNE-2Z细胞放疗敏感性*

刘世情， 周丛然， 唐鑫伟， 周汉芬， 李雪苛， 侯秀颖， 杨海峰， 朱林燕△

（1暨南大学基础医学与公共卫生学院药理学系，广东 广州 510632；2广东省中医院病理科，广东 广州 510120；3广东省中医院大学城医院放射科，广东 广州 510006；4广州华商学院，广东 广州 511300）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是以低分化鳞状细胞癌为主的一种头颈部恶性肿瘤，好发于东南亚以及我国的华南地区［1］。由于鼻咽癌细胞对于射线非常敏感，放疗通常作为鼻咽癌的首选治疗方式［2］。近年来，由于放射技术的提高，鼻咽癌的放射治疗手段从传统的二维放射治疗及常规的三维适形进展到调强放射治疗（intensity-modulated radiation therapy， IMRT），这使鼻咽癌患者的局部控制率及总体生存率得到极大的改善［3-4］。然而，不可避免的是，放射对局部正常组织的损伤、肿瘤靶区对射线的抵抗性及鼻咽癌的复发、远处转移依然存在［5］。如何提高射线对肿瘤靶组织的敏感性，降低射线对正常组织的辐射损伤，减少鼻咽癌的残留及复发仍然是临床亟待解决的棘手问题。

双氢青蒿素（dihydroartemisinin， DHA）是从中药青蒿素中提取出的一种生物利用度较高的活性中药单体。DHA除用于传统的抗疟疾外，相继发现它也具有抗肝癌［6］、食道癌［7］、乳腺癌［8］、前列腺癌［9］及头颈部鳞状细胞癌［10］等多种恶性肿瘤的能力。随着近几年对DHA研究的进一步深入，发现DHA可提高某些肿瘤如淋巴瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌和神经胶质瘤的放射敏感性［11-12］，有望成为新一代的高效低毒的靶向放疗增敏剂。然而DHA对鼻咽癌是否具有放疗增敏作用以及其放疗增敏作用的机制目前尚未阐明。

氯通道是广泛存在于机体细胞内最重要的一种阴离子通道，它广泛参与肿瘤发生发展的多种细胞生物学行为，如细胞周期调控、细胞增殖与迁移、凋亡、细胞容积与胞内pH调节等［13-15］，这表明氯通道可作为治疗恶性肿瘤的潜在靶点。本课题组前期研究发现鼻咽癌细胞的ClC-3氯通道蛋白的表达高于正常鼻咽上皮组织细胞［16］；DHA可诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞ClC-3氯通道蛋白表达［17］。在此基础上，本研究以鼻咽癌CNE-2Z细胞以及正常的鼻咽上皮细胞NP69-SV40T为实验对象，探讨DHA对鼻咽癌细胞增敏作用及其机制，以期为DHA联合放疗治疗鼻咽癌的提供实验依据。

材料和方法

1 细胞培养

人低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z由广东医科大学唐慰萍教授惠赠；正常的鼻咽上皮细胞NP69-SV40T购于湖南湘雅医学院细胞库，本室保种于液氮罐中。上述细胞用含10%小牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基培养，生长在37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱内。隔天用0.25%胰酶和0.02% EDTA进行消化传代。

2 试剂及溶液

双氢青蒿素购自Sigma，用DMSO溶解配成160 mmol/L的母液，于冰箱4 ℃避光保存；3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）购自Sigma，用PBS溶解并经0.22 μm的微孔滤膜过滤，避光分装成1 mL/支保存于-20 ℃；5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoic acid（NPPB）购自Sigma，DMSO配制成浓度为100 mmol/L储存液，实验时稀释至100 μmol/L工作液浓度；抗ClC-3抗体购自Abcam；抗GAPDH抗体购自贤至生物科技有限公司；山羊抗兔IgG购自鼎国科技有限公司；siRNA购于吉玛基因公司。

电极内液组成（mmol/L）：70N-methyl-D-glutamine chloride （NMDG-Cl），1.2 MgCl2，10 HEPES，1 EGTA，140 D-mannitol，2 ATP。

等渗液（ISO）含（mmol/L）：70 NaCl，0.5 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES，140 D-mannitol。低渗液（47% Hypo） 渗透压为160 mOsmol/L，除不含D-mannitol外，其余成分均同于等渗灌流液。配制好的液体用Osmomat 030冰点渗透压计（Osmomat 030；Gonotec，Germany）测定渗透压，Tris碱调pH至7.4。

3 实验方法

3.1 MTT法检测DHA对CNE-2Z细胞和NP69-SV40T细胞活力的抑制作用 取对数生长的上述两株细胞经胰酶消化后接种于96孔板中，8 000个/孔，细胞过夜贴壁，分别加入0、5、10、20、40、80和160 mmol/L DHA，每组8个复孔，作用24、48及72 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液（5 g/L），37 ℃避光孵育4 h，吸去培养液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，振荡使孔里的紫色结晶完全溶解，酶标仪检测490 nm波长的吸光度（A）值。计算公式：增殖抑制率（%）=（A对照组-A加药组）/A对照组×100%。应用GraphPad Prism 9.0软件计算10%和50%抑制浓度即IC10和IC50。后续将采用IC10进行放射增敏实验。

3.2 平板集落形成实验 取对数生长的CNE-2Z细胞胰酶消化后接种于6孔板中，每孔1 000个，待过夜贴壁。根据实验进行分组，对照组、DHA+不同剂量放射组、氯通道阻断剂NPPB（或NC siRNA）组+不同剂量放射组、DHA+NPPB（或ClC-3 siRNA）组+不同剂量放射组。各组药物最终浓度分别为DHA 5 μmol/L、NPPB 50 μmol/L。继续培养24 h后分别给予0、2、4、6和8 Gy的X加速直线射线照射，该部分实验在广东省中医院放射科进行，由技师专业操作。放射完成后，置于37 ℃孵箱12 h后更换新鲜培养液继续培养10 d，在孔板中看到肉眼可见的细胞集落时终止实验，固定、Giemsa染色、计数。集落形成率=集落数目/接种细胞数×100%；存活分数（SF，%）=集落形成率处理组/集落形成率对照组×100%，利用单击多靶模型SF=1-（1-e-Dq/D0）N，其中SF是细胞的生存分数，Dq代表准阈剂量，D0表示平均致死量，N为外推数，lnN=Dq/D0拟合曲线并得出放射增敏指数（sensitization enhancement ratio， SER）。

3.3 全细胞膜片钳技术检测细胞氯电流 常规消化细胞，然后取200 μL的细胞悬液滴到直径为22 mm圆形玻片上（每片100～200 μL），孵育40 min待贴壁，玻片安放在灌流槽中，用等渗液灌流细胞5 min使其适应实验环境。用EPC-10膜片钳放大器（List Electronic）记录全细胞氯电流。电流和电压信号用CED1401（Cambridge）数字化（采样频率3 kHz），实验数据用EPC（CED， Cambridge）软件分析。采用的±40、0和±80 mV循环钳制电压，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔4 s。在等渗条件下记录3～5 min的背景氯电流，而后灌流5 μmol/L DHA溶液观察细胞氯电流的变化，待电流平稳后，换为5 μmol/L DHA+100 μmol/L的NPPB溶液。NC siRNA和ClC-3 siRNA处理组等渗条件下记录3～5 min的背景氯电流，而后灌流5 μmol/L DHA溶液观察细胞氯电流的是否存在差异。

3.4 Western blot检测蛋白表达 取对数生长的鼻咽癌CNE-2Z细胞消化后接种于6孔板中，待细胞24 h贴壁后，加入5 μmol/L的DHA溶液，分别培养3、6、12和24 h后弃去6孔板中的培养基，把孔板置于冰上，整个过程在冰上操作。收集细胞总蛋白并进行BCA蛋白定量，根据蛋白浓度计算20 μg蛋白上样量。用10% SDS-PAGE根据分子量大小分离蛋白，结束后将目的蛋白进行切胶并转移到PVDF膜上，牛奶封闭2 h后，加入用Ⅰ抗稀释液配好的GAPDH抗体，以及ClC-3羊抗兔的多克隆抗体，置于4 ℃摇晃过夜；第2天，回收Ⅰ抗，然后用TBST洗涤膜3次，每次10 min，加入用TBST稀释好的Ⅱ抗稀释液，在室温下孵育1 h后用TBST漂洗5～10 min，洗涤3次；最后采用ECL化学发光法进行显影；采用图像分析软件ImageJ进行图像分析。

3.5 细胞转染实验 转染前一晚将CNE-2Z细胞常规消化接种于6孔板，每孔1.5×106个细胞过夜待贴壁，带细胞密度达70%～80%时去除旧培养基，PBS洗两次，每孔加入600 μL Opti-MEM浸润，孵箱静置20 min。配制转染试剂：取10 μL GP-transfectmate与10 μL siRNA轻轻吹打混合，然后静置20 min。然后在混合液中加入400 μL Opti-MEM中。阴性对照（negative control， NC）管操作相同。混合均匀后加入到对应的转染孔中，将细胞放入孵箱中培养，根据具体转染要求在6～10 h内更换新的培养基。转染48 h后，Western blot检测细胞ClC-3蛋白表达。ClC-3 siRNA的正向序列为5'-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3'，反向序列为5'-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA-3'；NC siRNA的正向序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向序列为5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

4 统计学处理

运用SPSS 25.0软件进行分析。实验重复3次以上，计量资料均采用均数±标准差（mean±SD）表示，两组数据间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析及q检验。以P＜0.05表示差异存在统计学意义。

结 果

1 DHA呈浓度和时间依赖性抑制CNE-2Z细胞活力

用5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA作用于细胞不同时间，可观察到鼻咽癌CNE-2Z细胞从DHA浓度5 μmol/L开始，细胞数逐渐减少，随着DHA浓度越大其变化越明显。然而，在正常的鼻咽上皮NP69-SV40T细胞，DHA增加到20 μmol/L左右才观察到数量和形态的显著改变（图1A）。细胞存活率实验进一步发现DHA随着时间和浓度的增加对CNE-2Z细胞活力抑制作用也增加，DHA作用48 h时其IC50值为（39.17±4.760） μmol/L，IC10值为（5.244±1.050） μmol/L；然而，DHA作用48 h对NP69-SV40T细胞其IC50值则高达为（159.3±7.235） μmol/L（P＜0.01），IC10值为（13.02±4.831） μmol/L，见图1B～D。将选择与DHA细胞IC10值较近的5 μmol/L作为后续的实验浓度。

2 DHA可促进CNE-2Z细胞对射线敏感性

通过集落形成实验检测单独放射组以及DHA联合放射组的细胞集落数，从图2A、2B中可发现DHA联合放射组的细胞集落数量比单独放射组少（P＜0.05），利用单击多靶模型SF=1-（1-e-Dq/D0）N，其中SF是细胞的生存分数，Dq代表准阈剂量，D0表示平均致死量，N为外推数，lnN=Dq/D0。经过曲线拟合，见图2C所示，得出DHA的放疗增敏比（SER）=D0放射组/D0联合放射组，SER=1.9，提示DHA具有增加CNE-2Z对放射敏感作用。

Figure 2.The radiosensitization effect of DHA on CNE-2Z cells was detected by clone formation assay.A： optical images of CNE-2Z cells after treated with radiation and radiation plus DHA；B： the number of CNE-2Z cell colonies after radiation and DHA plus radiation；C： dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs radiation group.图2 集落形成实验检测DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用

3 DHA对CNE-2Z及NP69-SV40T细胞氯通道功能的影响

通过全细胞膜片钳实验观察两株细胞氯通道功能是否受到DHA的影响。研究发现，在0、±40和±80 mV的电压钳制下，胞外灌流等渗溶液5 min，可看到一段很小且稳定的基础电流，更换DHA后CNE-2Z细胞的电流被激活，在±80 mV电压钳制下，DHA激活CNE-2Z细胞的电流密度逐渐增大至（50.94±5.616） pA/pF和（-22.98±3.485） pA/pF，如图3A，在NP69-SV40T细胞DHA则无此作用，进一步灌流低渗刺激仍能激活电流（P＜0.01），见图3B～C。

4 DHA可诱导CNE-2Z细胞的ClC-3氯通道蛋白表达增加

上述数据表明，DHA可以激活CNE-2Z细胞的氯电流。接下来我们检测DHA作用不同时间点对CNE-2Z细胞ClC-3氯通道蛋白表达的影响。DHA分别作用0、3、6、12和24 h，可观察到随着DHA作用时间增加，CNE-2Z细胞ClC-3蛋白的表达也随之增加，表现出时间依赖性，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。

Figure 4.Effect of DHA on ClC-3 protein expression in CNE-2Z cells at different time points.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 h group.图4 DHA作用不同时间对CNE-2Z细胞ClC-3蛋白表达的影响

5 氯通道阻断剂NPPB可抑制DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用

根据前面的研究结果得出DHA可激活鼻咽癌CNE-2Z氯通道，且具有放射增敏的作用。那么，DHA放射增敏作用是否有氯通道参与呢？为证明这一点，利用氯通道阻断剂观察其是否影响DHA放射增敏作用。结果发现，DHA+NPPB组的细胞集落数明显多于DHA组（P＜0.05），见图5A、B。利用单击多靶模型曲线拟合可得出，DHA组的放射增敏比SER=1.42，DHA+NPPB组的放射增敏比则为SER=0.77，增敏比抑制率为1.84（图5C）。这表明NPPB可显著地抑制DHA对鼻咽癌CNE-2Z细胞的放射增敏作用。进一步全细胞膜片钳检测到在±80 mV电压钳制下，DHA激活CNE-2Z细胞的电流显著被NPPB抑制，从（58.88±6.539） pA/pF和（-27.57±6.900） pA/pF 降 至（14.41±3.549） pA/pF 和（-8.763±5.686） pA/pF（P＜0.01，图5D～5E）。

Figure 5.The chloride channel blocker NPPB inhibitd DHA radiation sensitization and activated chloride current.A： optical images of CNE-2Z cells after treated with radiation， radiation+DHA， radiation+NPPB and radiation+DHA+NPPB；B： the number of CNE-2Z cell colonies after treated with radiation， radiation+DHA， radiation+NPPB and radiation+DHA+NPPB；C：dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching；D： DHA could induce Cl- current in CNE-2Z cells as shown with a typical time course；E： the mean densities of the DHA-activated Cl- currents by NBBP at ±80 mV clamp voltage.Mean±SD.n=5.*P＜0.05， **P＜0.01 vs DHA group.图5 氯通道阻断剂NPPB抑制DHA放射增敏和激活氯电流作用

6 ClC-3 siRNA抑制DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用

为证实ClC-3氯通道蛋白是否为DHA促进CNE-2Z细胞的放射增敏的氯通道分子基础，利用siRNA干扰技术下调CNE-2Z细胞ClC-3蛋白表达，Western blot结果显示ClC-3 siRNA处理后的细胞ClC-3的蛋白表达量明显少于无序列干扰RNA组（P＜0.01），见图6A。同时发现ClC-3 siRNA+DHA组的细胞集落数明显多于NC siRNA+DHA组（P＜0.01），见图6B。利用单击多靶模型曲线拟合可得出，NC siRNA+DHA组的放射增敏比SER=2.01，DHA+ClC-3 siRNA组的放射增敏比SER=0.48，增敏比抑制率是4.19，见图6C。这表明ClC-3 siRNA可抑制DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用。进一步全细胞膜片钳检测到，NC siRNA组细胞在±80 mV电压钳制下，DHA激活 的 氯 电 流 分 别 为（59.38±3.807） pA/pF和（-28.87±6.405） pA/pF；然而，DHA无法激活ClC-3 siRNA组细胞的氯电流，进一步灌流低渗刺激仍能激活电流（P＜0.01），见图6D～F。

Figure 6.ClC-3 siRNA inhibited the radiosensitizing effect of DHA on nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells.A： the representative Western blot analysis and densitometry quantitation demonstrated the interference efficiency of ClC-3 siRNA（n=3）；B： colony formation of CNE-2Z cells after treated with NC siRNA， NC siRNA+DHA， ClC-3 siRNA and ClC-3 siRNA+DHA；C： dose-survival curve obtained from multi-target single-hit model matching；D and E： typical time course of DHAactivated Cl- currents in the cells treated with NC siRNA （D） and ClC-3 siRNA（E；Hypo： hypotonic solution）；F： the mean densities of the DHA-activated Cl- currents in the cells treated with NC siRNA and ClC-3 siRNA at ±80 mV clamp voltage.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs NC siRNA+DHA group.图6 ClC-3 siRNA可抑制DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用

讨 论

鼻咽癌患者以放射治疗为主，中晚期的鼻咽癌患者考虑放化疗的综合疗法［5］。尽管目前的放射治疗学的技术有很大的提高，但仍然存在部分患者经一段时间放射后出现正常组织辐射损伤，如口干、听视力下降、吞咽困难、皮肤组织纤维化、张口困难、脑损伤［18］；此外乏氧细胞对辐射的抗性，从而限制肿瘤放疗疗效也是目前亟需解决的问题［19］。

针对辐射抗性，基础和临床放疗研究也有很多尝试，如加大放疗的剂量、使用乏氧细胞增敏剂、放化疗联合应用等［20］，尽管多年来人们对放射增敏进行了大量的研究，然而目前安全有效的放射增敏药物远远不能满足临床需求。因此，寻找一种高效低毒放疗增敏剂是非常迫切的。在本研究中，我们通过细胞增殖实验以及集落形成实验选用使用可抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的生长繁殖，而对正常的鼻咽上皮细胞几乎没有抑制作用5 μmol/L的DHA，联合X射线增强后者对CNE-2Z的敏感性，表明DHA具有对鼻咽癌细胞高效低毒的放射增敏作用。近些年来，有部分研究也证实DHA可增强宫颈癌、非小细胞肺癌和神经胶质瘤的放射敏感性，其主要的机制主要集中在以下几方面：（1）DHA通过废除G2周期检验点，阻止有丝分裂前期细胞发挥修复损伤的DNA的作用而发挥放疗增敏效应［21］；（2）可通过肿瘤细胞内的Fe2+催化青蒿素类物质的过氧键裂解，产生大量以青蒿素碳原子为中心的氧自由基，后者诱导细胞毒作用而促进放疗增敏［22］；（3）在低氧环境DHA通过增加细胞内ROS的合成及阻碍DNA的损伤修复过程促进放疗效应［23］。然而DHA通过何种途径在短时间的放射内提高射线的敏感性以及阻碍放射后癌细胞的DNA的修复过程仍然存在很大的争议，人们对DHA的放射增敏作用的机制也并未完全清楚。

氯通道在机体的生理病理状态下都起到非常大的作用，广泛参与肿瘤发生发展的多种细胞生物学行为，如细胞容积调节、细胞增殖、迁移、凋亡等［24-25］。我们前期对鼻咽癌研究发现，DHA可选择性的激活氯电流，诱导Cl-外流，引起AVD，导致［Ca2+］i积累，并激活caspase-3，最终诱导CNE-2Z细胞凋亡［17］。 然而ClC-3氯通道是否参与DHA对鼻咽癌的增敏作用还尚未报道。在本课题中，我们发现DHA可激活鼻咽癌CNE-2Z细胞的氯电流，且该电流可被氯通道阻断剂NPPB抑制。此外，氯通道阻断剂NPPB也可抑制DHA对鼻咽癌CNE-2Z细胞放射增敏效应，这提示氯通道参与DHA放射增敏的过程。紧接着，我们通过检测DHA作用鼻咽癌CNE-2Z细胞3、6、12和24 h的ClC-3蛋白表达，结果发现仅在3 h的作用下，ClC-3氯通道蛋白表达增加，随着作用时间增加，蛋白的表达量也随之增加；此外，下调CNE-2Z细胞的ClC-3蛋白后，DHA无法激活其氯电流，并且可抑制DHA对鼻咽癌CNE-2Z细胞的放射增敏，抑制比达4.18倍。这说明ClC-3蛋白有可能是在DHA增敏过程起到关键作用。大量研究报道DHA可通过增加细胞的ROS合成来提高肿瘤组织的乏氧程度，进而提高改善肿瘤对射线的抵抗。有趣的是，有研究证实某些抗肿瘤药物可诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞的ROS增加介导ClC-3氯通道的激活达到抗肿瘤作用［26］，另外，也有研究发现鼻咽癌CNE-2Z细胞ROS含量增加，可上调ClC-3蛋白的表达介导细胞自噬产生［27］。而在本研究中是否存在ROS参与DHA介导ClC-3氯通道激活还有待进一步的探究。总之，ClC-3氯通道蛋白在DHA对鼻咽癌放射增敏过程作为潜在新靶点的研究有助于为临床放疗增敏剂的研发和合理使用提供新的观点和实验依据。