基于p53/SLC7A11/GPX4信号轴探讨七叶内酯诱导小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的作用机制*

何 丹， 李琳霈， 谭小宁， 郜文辉， 田雪飞， 曾普华

（1湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006；2湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208）

据2020年国际肿瘤研究机构（International Agency for Research on Cancer， IARC）数据显示，乳腺癌在我国女性肿瘤新发病例中位居第一［1］。约5%的患者确诊即为乳腺癌晚期，失去最佳手术机会，40%患者即使进行标准治疗仍会进展为晚期，且恶性程度高，治疗手段局限，导致乳腺癌患者预后较差，治疗效果不理想［2］。

近年来，中医药在乳腺癌综合治疗中的地位越来越重要。透骨草是大戟科地构叶属植物地构叶［Phryma leptostachya subsp.asiatica（Hara） Kitamura］的全草，具有祛风除湿、舒筋活血、散瘀消肿和解毒止痛之功效［3］。现代药理学研究证明，透骨草在镇痛、抗炎、抗肿瘤等方面具有广泛的药理学作用［4］。七叶内酯（esculetin）是透骨草的主要活性成分之一［5］。研究发现，七叶内酯不仅具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等药理活性，在抗肿瘤方面也凸显出重要作用，但其具体作用机制未明［6］。

因此，本研究旨在探讨七叶内酯对小鼠乳腺癌4T1细胞的影响及其可能的作用机制，以期为七叶内酯的抗肿瘤作用提供实验基础及理论支撑。

材料和方法

1 生信分析

1.1 分子对接 从PubChem下载七叶内酯的3D化学结构图和SDF文件，使用Pymol将其转换为PDB格式，然后使用AutoDockTools将PDB格式转换为PDBQT文件。文件转换后使用Autodock Vina进行分子对接，通过Pymol构建分子对接结合位点图。

1.2 生存分析 采用R软件survival、survminer包，绘制Kaplan-Meier曲线，根据基因表达的中位数分为高（high）、低（low）两组，分别评估铁死亡（ferroptosis）相关蛋白p53、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7， member 11， SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）对乳腺癌患者生存状况的影响。采用R软件time-ROC包，绘制时间依赖性受试者工作特征（time-receiver operating characteristic， time-ROC）曲线，分别评估铁死亡相关蛋白p53、SLC7A11和GPX4对乳腺癌患者1、3和5年的生存预测效能。

2 体外实验

2.1 药品及试剂 七叶内酯（GC38236）购于GLPBIO；阳性对照药卡培他滨（capecitabine；220618KF）购于江苏恒瑞医药股份有限公司；铁死亡诱导剂erastin（B1524）和铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1；A4371）购于APExBIO；丙二醛（malondialdehyde， MDA）试剂盒（YD-20206）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）试剂盒（YD-20344）和GPX4试剂盒（YD-28280）购于厦门仑昌硕生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species， ROS）试剂盒（E004-1-1）购于南京建成生物工程研究所；亚铁离子（Fe2+）试剂盒（TC1015）购于雷根生物科技有限公司；GPX4抗体（sc-166570）和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）抗体（sc-365230）购自Santa Cruz；SLC7A11抗 体（MA5-44922）购 自Thermo Fisher；p53抗 体（ab26）购自Abcam。

2.2 细胞及细胞培养 小鼠源性乳腺癌4T1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的1640培养基置于二氧化碳培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养，隔天观察细胞贴壁情况并换液，传代时间为3～4 d。选用对数生长期细胞进行下一步实验。

2.3 分组及干预 实验共设6组，分别为对照（control）组、1/2 IC50组、IC50组、2 IC50组、erastin组和卡培他滨组，每组5个复孔，重复3次。其中，对照组不用药物处理，药物干预组按CCK-8实验结果分别用不同剂量七叶内酯（25、50和100 mg/L）、erastin（10 μg/L）、卡培他滨（1 mg/L）干预24 h。

2.4 检测指标及方法

2.4.1 CCK-8细胞活力检测 采用CCK-8检测七叶内酯不同浓度对4T1细胞毒性和活力的影响，筛选药物干预浓度。4T1细胞按每孔5×103个的密度种于96孔板，过夜后分别用不同浓度七叶内酯处理24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h，酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值。实验每组5个复孔，重复3次。

2.4.2 电镜观察线粒体形态 4T1细胞以每孔2×105个的密度接种于6孔板，药物干预24 h后收集细胞，电镜固定液室温避光固定30 min，4 ℃过夜，脱水、包埋、切片、染色，并在电镜下观察细胞线粒体形态改变，评估线粒体损伤情况。

2.4.3 荧光探针法检测细胞内ROS水平 4T1细胞以每孔2×105个的密度接种于6孔板，孵育过夜后用相应药物干预24 h，每孔加入500 μL终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA荧光素，入培养箱避光孵育30 min，PBS洗去未进入细胞的探针，置于荧光显微镜下观察DCF荧光强度。

2.4.4 试剂盒检测Fe2+、MDA、GSH和GPX4水平4T1细胞以每孔2×105个的密度接种于6孔板，药物干预24 h后收集细胞上清，按照相应试剂盒说明书检测Fe2+、MDA、GSH和GPX4水平，以反映4T1细胞脂质过氧化程度。

2.4.5 划痕实验 通过划痕实验检测细胞迁移能力。用直尺在6孔板底部均匀划横线，4T1细胞以每孔2×105个的密度种板，过夜后用无菌枪头划痕，用PBS洗去不贴壁细胞，更换新鲜培养基，加入相应干预药物。分别于0 h、12 h和24 h在显微镜下拍照。

2.4.6 Transwell小室实验 通过Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。Matrigel胶稀释后均匀涂抹于上室表面，37 ℃放置0.5～1 h，使其聚合成凝胶。取对数生长期4T1细胞100 μL加入上室，于培养箱中培养24 h。取出小室，固定、染色、风干后高倍显微镜下观察细胞。

2.4.7 Western blot检测p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表达水平 4T1细胞以每孔7×105个的密度接种于大皿，药物干预24 h后收集细胞，用预冷PBS清洗3遍后进行裂解、蛋白提取，使用BCA法进行蛋白定量后制样。配胶、上样、电泳、转膜、封闭、Ⅰ抗孵育、洗膜、Ⅱ抗孵育、洗膜、曝光后收集蛋白条带，分析灰度值。

3 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料若为正态分布，用均数±标准差（mean±SD）进行统计描述，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两均数比较采用Tukey法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 生信分析

1.1 分子对接 将p53、SLC7A11和GPX4与七叶内酯进行分子对接，展示结合位点。结果表明，七叶内酯与p53、SLC7A11和GPX4具有良好的结合活性，在结合位点紧密相连，其结合能分别为-7.1、-5.3和-7.0，对接结果中结合能（affinity值）越小，说明七叶内酯与p53、SLC7A11和GPX4的相互作用越稳定（图1）。

Figure 1.Molecular docking of esculetin with p53， SLC7A11 and GPX4.A： the 3D chemical structure chart of esculetin；B， C and D：the protein structure p53， SLC7A11 and GPX4；E， F and G： the binding site of esculetin with p53， SLC7A11 and GPX4.图1 七叶内酯与p53、SLC7A11和GPX4的分子对接

1.2 生存分析 Kaplan-Meier和time-ROC生存预后分析均提示，在乳腺癌患者中，p53， SLC7A11和GPX4的表达与其生存预后密切相关。Kaplan-Meier曲线生存状况结果显示：p53、SLC7A11和GPX4的表达与乳腺癌患者的生存预后相关（P＜0.05），见图2A～2C。time-ROC生存预测结果显示，p53在1、3和5年生存预后中的预测效能分别为0.502、0.474、0.505，SLC7A1的预测效能分别为0.493、0.597和0.548，GPX4的预测效能分别为0.603、0.468和0.438，见图2D～2F。

Figure 2.Prognostic analysis of p53， SLC7A11 and GPX4 in breast cancer patients.A， B and C： the Kaplan-Meier curves of p53，SLC7A11 and GPX4；D， E and F： the time-ROC curves of p53， SLC7A11 and GPX4.图2 乳腺癌患者中p53、 SLC7A11和GPX4的预后分析

2 体外实验

2.1 七叶内酯对4T1细胞活力的影响 CCK-8实验结果显示，与空白组比较，当七叶内酯浓度≤6.25 mg/L时，对4T1细胞活力未见明显抑制作用；当七叶内酯浓度为50 mg/L时，对4T1细胞的抑制率约为50%，即七叶内酯对4T1细胞的IC50为50 mg/L；当七叶内酯浓度为100 mg/L时，对4T1细胞的抑制率≥50%。因此，后续实验中选取25 mg/L（1/2 IC50）、50 mg/L（IC50）和100 mg/L（2 IC50）作为七叶内酯的干预剂量（图3）。

Figure 3.Effect of esculetin on the viability of 4T1 cells.CCK-8 was used to detect the effects of different concentrations of esculetin on the viability of 4T1 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 七叶内酯对4T1细胞活力的影响

2.2 七叶内酯对4T1细胞线粒体形态的影响 线粒体电镜结果显示，对照组细胞线粒体形态正常，结构完整，线粒体嵴的数目及形态正常，细胞核膜结构清晰；与对照组比较，七叶内酯能损伤线粒体形态，使线粒体嵴减少甚至消失，细胞核膜结构不清晰（图4）。

Figure 4.Effect of esculetin on mitochondrial morphology of 4T1 cells.After 24 h of drug intervention， the 4T1 cells were collected，and the morphological changes of mitochondria were observed under electron microscope.图4 七叶内酯对4T1细胞线粒体形态的影响

2.3 七叶内酯对4T1细胞ROS水平的影响 如图5所示，与对照组比较，七叶内酯干预能升高4T1细胞中ROS水平，其中七叶内酯1/2 IC50、IC50和2 IC50组分别升高了21.49%、32.06%和45.17%（P＜0.05）；与七叶内酯IC50组比较，erastin和卡培他滨组ROS水平分别升高了15.82%和12.51%。

Figure 5.Effect of esculetin on ROS levels in 4T1 cells.The 4T1 cells were treated with DCFH-DA fluorescent probe for 30 min after 24 h of drug intervention， and the fluorescence intensity was observed under fluorescence microscope.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.图5 七叶内酯对4T1细胞ROS水平的影响

2.4 七叶内酯对4T1细胞脂质过氧化程度的影响如图6所示，与对照组比较，七叶内酯干预能升高4T1细胞中Fe2+和MDA水平，降低GSH和GPX4水平。其中，七叶内酯1/2 IC50、IC50和2 IC50组Fe2+及MDA水平分别升高了1.85倍、2.17倍和2.94倍，以及0.4倍、2.1倍和3.82倍（P＜0.05）。七叶内酯1/2 IC50、IC50和2 IC50组GSH和GPX4水平分别降低了0.22倍、0.39倍和0.46倍，以及0.19倍、0.38倍和0.49倍（P＜0.05）。

Figure 6.Effect of esculetin on the degree of lipid peroxidation in 4T1 cells.After 24 h of drug intervention， the 4T1 cell supernatant was collected and the levels of Fe2+ （A）， GPX4 （B）， GSH （C） and MDA （D） were detected by kits.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.图6 七叶内酯对4T1细胞脂质过氧化程度的影响

2.5 七叶内酯对4T1细胞迁移能力的影响 如图7所示，对照组中4T1细胞生长状态及迁移能力良好，随时间推移划痕逐渐变窄，说明4T1细胞具有较好的迁移能力。与对照组比较，七叶内酯干预能降低4T1细胞的迁移能力（P＜0.05）。其中，0 h时各组细胞迁移能力无变化，12 h时可见细胞迁移，24 h时细胞药物干预组迁移缓慢，划痕较对照组增宽。

Figure 7.Effect of esculetin on migration ability of 4T1 cells.Scratch healing was observed at 0， 12 and 24 h after drug intervention.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.图7 七叶内酯对4T1细胞迁移能力的影响

2.6 七叶内酯对4T1细胞侵袭能力的影响 如图8所示，对照组中4T1细胞穿膜数为307.60±28.95，七叶内酯1/2 IC50组、IC50组和2 IC50组4T1细胞穿膜数分 别 为241.60±20.75、173.50±14.94和133.80±12.51，erastin和卡培他滨组4T1细胞穿膜数分别为130.6±11.24和116.2±10.85，显著低于对照组（P＜0.05），提示七叶内酯、erastin和卡培他滨可抑制4T1细胞侵袭能力，且呈剂量依赖性。

Figure 8.Effect of esculetin on the invasion ability of 4T1 cells.The invasion of 4T1 cells was observed after 24 h of drug intervention in Transwell chamber.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.图8 七叶内酯对4T1细胞侵袭能力的影响

2.7 七叶内酯对4T1细胞p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表达的影响 如图9所示，与对照组比较，七叶内酯、erastin和卡培他滨干预后的4T1细胞中SLC7A11和GPX4蛋白表达降低，p53和ACSL4蛋白表达升高（P＜0.05），提示七叶内酯、erastin、卡培他滨可通过调控铁死亡相关的p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表达诱导4T1细胞铁死亡。

Figure 9.Effect of esculetin on ferroptosis related proteins in 4T1 cells.After 24 h of drug intervention， 4T1 cells were collected and Western blot experiment was performed to observe the protein expression of p53， SLC7A11， GPX4 and ACSL4.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.图9 七叶内酯对4T1细胞铁死亡相关蛋白的影响

讨 论

七叶内酯是我国传统中药透骨草的重要活性成分。近年来，其其抗肿瘤药理活性在越来越多的研究中得到证实［7-8］。erastin是一种铁死亡诱导剂，能够诱导非凋亡的细胞死亡，这种诱导效应取决于氧化应激水平和细胞铁的积累［9］。卡培他滨是一种抗肿瘤药物，具有抑制细胞分裂、干扰蛋白质合成、抑制肿瘤生长等作用［10］。铁死亡是一种铁依赖性的，不同于凋亡、自噬、坏死的细胞程序性死亡方式，近年来与肿瘤的发生发展密切相关［11］。因此，本实验探讨了七叶内酯在乳腺癌4T1细胞铁死亡中的作用及其分子机制。

铁死亡的发生机制主要与细胞脂质过氧化以及抗氧化系统失活相关［12］。在脂质过氧化中，Fe2+是铁死亡最直接的促进因素，是铁死亡的典型标志之一［13］。Fe2+的累积会导致细胞膜脂质过氧化反应，甚至诱导氧化应激，促进ROS和MDA大量累积，引起细胞死亡［14］。在本实验中，我们以不同浓度（25、50和100 mg/L）的七叶内酯对4T1细胞进行了干预，结果发现七叶内酯处理可明显降低细胞存活率。在Fe2+、ROS和MDA的检测中发现，七叶内酯干预后的4T1细胞中Fe2+、ROS和MDA水平升高，提示七叶内酯能促进4T1细胞脂质过氧化反应。

GSH和GPX4在铁死亡的抗氧化系统中起主要作用［15］。GSH是细胞中的主要抗氧化剂，也是GPX4的首选底物，GSH在GPX4的作用下会减少 ROS在细胞中的累积，进而抑制铁死亡［16］。相反，GSH和GPX4活性的抑制可导致脂质过氧化物积累，同时，ACSL4可激活多不饱和脂肪酸，协同促进脂质过氧化反应，加速铁死亡的发生［17］。SLC7A11是铁死亡中的关键上游调节因子之一，p53是一种肿瘤抑制基因。研究发现，p53可通过抑制SLC7A11的表达及活性，调节GPX4表达，促进细胞发生铁死亡［18］。本研究在GSH和GPX4的检测中发现，七叶内酯干预后的4T1细胞中GSH和GPX4水平降低，Western blot结果显示SLC7A11和GPX4蛋白表达水平降低，p53和ACSL4蛋白表达水平升高，提示七叶内酯可通过调控p53、SLC7A11、GPX4和ACSL4蛋白表达诱导4T1细胞铁死亡。为验证七叶内酯是否通过铁死亡促进细胞死亡，本实验采用铁死亡抑制剂Fer-1对4T1细胞进行阻断实验，结果发现，Fer-1干预可逆转七叶内酯诱导的铁死亡。

此外，线粒体在半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡中起着关键作用，主要原因是半胱氨酸缺乏会导致线粒体膜电位超极化和脂质过氧化物积累，进而诱发铁死亡［19-20］。本实验对4T1细胞线粒体进行了观察，结果发现对照组细胞线粒体形态正常，结构完整，线粒体嵴的数目及形态正常，细胞核膜结构清晰；而七叶内酯处理后的细胞线粒体形态出现损伤，线粒体嵴减少甚至消失，细胞核膜结构不清晰。

肿瘤细胞的迁移和侵袭是导致肿瘤患者预后不良的重要原因，因此，本研究还进行了细胞划痕及Transwell小室实验，以检测七叶内酯对4T1细胞迁移和侵袭能力的影响。实验结果表明，七叶内酯可降低细胞划痕愈合能力及侵袭细胞数量，并伴有浓度依赖性，说明七叶内酯可抑制4T1细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，本研究结果表明，七叶内酯可抑制4T1细胞的增殖、迁移及侵袭能力，并通过调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路诱导4T1细胞发生铁死亡，进而抑制乳腺癌的发生发展，为七叶内酯可能成为新型抗肿瘤药物提供了实验依据。