叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化*

孙缦利， 邓海峰， 金少举，2， 陈旭东， 王兴红， 范文娟，2△

（1漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462000，2河南省营养与健康工程研究中心，河南 漯河 462000）

骨骼肌约占健康人体体重的40%，在机体运动、能量调节和机体稳态维持等方面发挥重要的作用［1］。骨骼肌是一种具有较强可塑性的组织，当骨骼肌因各种原因损伤后，可以通过再生过程修复受损骨骼肌。骨骼肌再生的过程主要涉及到骨骼肌成肌细胞的增殖、分化、迁移、多核肌管和肌纤维的形成等多个阶段，但整个过程发生的比较缓慢［2］。因此，寻找合适的干预措施促进骨骼肌成肌细胞的分化、肌管和肌纤维的形成，从而提高骨骼肌损伤后的修复速度，助力运动机能的恢复，具有重要的临床意义。

叶酸（folic acid， FA）是一种水溶性维生素，可以作为辅助因子为DNA的合成提供单碳供体［3］。哺乳动物体内不能合成FA，因此，通过外源性膳食获得这种维生素是组成机体的细胞正常代谢所必需的。研究表明，饮食中缺乏FA会导致多种疾病发生，如神经管缺陷、肌肉无力和行走困难等［4］。一项针对中风的老年患者的随机双盲对照研究表明，与安慰剂对照组相比，口服FA和维生素B12可降低髋部骨折的发生率，同时也可以改善姿势稳定性和肌肉功能和力量［5］，这些研究表明，FA对骨骼肌功能有积极的作用。但是FA改善肌肉功能的机制目前尚不清楚。本项工作以小鼠C2C12成肌细胞为研究对象，观察不同浓度的FA对C2C12细胞增殖、分化的影响并试图探讨其中的作用机制，旨在为骨骼肌损伤后修复、骨骼肌功能的改善等方面的应用提供实验依据。

材料和方法

1 材料

SPF级小鼠骨骼肌C2C12成肌细胞购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；高糖DMEM培养液、马血清和青霉素/链霉素混合溶液均购自Gibco；FA标准品购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗鼠成肌细胞决定蛋白1（myoblast determination protein 1， MyoD）、成肌蛋白（myogenin， MyoG）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain， MyHC）抗体均购自Santa Cruz；兔抗鼠c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK， p-JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和磷 酸 化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK， pp38）抗体均购自GeneTex；胰蛋白酶、MTT试剂盒、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、EdU-488细胞增殖检测试剂盒、JNK特异性抑制剂SP600125和p38特异性抑制剂SB203580均购自上海碧云天生物技术有限公司。

2 主要方法

2.1 C2C12细胞培养及诱导分化 将C2C12细胞培养于含10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素混合溶液的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每2天换液1次，待细胞增殖融合达80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代或诱导分化。分化培养液为含有2%马血清+1%青霉素/链霉素混合溶液的DMEM培养液，每天更换一次分化培养液，分化4 d。采用免疫荧光法检测成肌细胞分化标志物MyHC的表达，肌分化程度用肌管中MyHC阳性细胞核数与总细胞核数的比值来量化，融合指数用有核细胞（≥5个）的细胞核数和总细胞核数的比值来表示［6］。

为了探索FA对小鼠C2C12成肌细胞增殖的影响，采用不同浓度（0、2.5、5、10和20 μmol/L）FA处理细胞。在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段，将细胞分为对照组（Ctrl组，FA 0 μmol/L）和FA组（FA组，FA 10 μmol/L），分别于分化第2天和第4天，采用免疫荧光染色和Western blot方法检测成肌细胞分化相关蛋白MyoD、MyoG和MyHC的表达水平，并统计各组细胞肌管形成情况。另外，为了探索JNK/p38信号通路在小鼠C2C12成肌细胞分化过程中的作用，将细胞分为Ctrl组、FA组、FA+SP600125组或FA+SB203580组。FA+SP600125组和FA+SB203580组C2C12成肌细胞先接受10 μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h，再经10 μmol/L的FA处理24 h，FA组经10 μmol/L FA处理24 h。抑制剂剂量选取参考［7］，分组处理参考［8］。

2.2 MTT法检测细胞活力 用MTT法［9］检测细胞活力，严格按照说明书进行操作。将C2C12细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液（含5 000个细胞），同时加入相应浓度的FA，培养48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO，在酶标仪上检测570 nm波长处吸光度（A）值。

2.3 EdU检测细胞增殖 用EdU-488细胞增殖实验检测C2C12细胞的增殖情况，严格按照说明书进行操作。将C2C12细胞接种于6孔板中（每孔含2×105个细胞），同时加入相应浓度的FA，培养48 h后，每孔加入10 μmol/L的EdU工作液，孵育2 h后，去除培养液，4% PFA室温固定15 min，0.3% Triton X-100室温通透15 min， Click反应液室温避光孵育30 min，荧光显微镜拍照。EdU标记指数用EdU染色阳性细胞核数和总细胞核数的比值来表示，EdU标记指数越高，说明细胞增殖能力越强［10］。

2.4 免疫荧光染色 将各组处理好的C2C12细胞用PBS清洗3次后，4% PFA室温固定15 min，0.3%Triton X-100室温通透15 min，然后加入Ⅰ抗（MyoD，1∶600；MyoG，1∶600；MyHC， 1∶300），4 ℃过夜孵育。PBS洗3次后，加入荧光标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h，再用DAPI染核5 min。荧光显微镜拍照。

2.5 Western blot 将各组处理好的C2C12细胞用PBS清洗3次后，加入含PMSF的RIPA裂解液裂解10 min，32 198×g离心3～5 min，取上清，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。用10% SDS-PAGE的电泳液，将蛋白进行电泳分离，然后将蛋白电转至PVDF膜。封闭液室温封闭15 min，Ⅰ抗（MyoD，1∶600；MyoG，1∶600；MyHC， 1∶300；p-JNK， 1∶1 000；JNK，1∶1 000；p-p38， 1∶1 000；p38， 1∶1 000）4 ℃过夜孵育，然后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育2 h。将膜置于凝胶成像仪中，加入ECL发光剂，曝光显影，采用ImageJ软件分析蛋白水平。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件和GraphPad Prism 6.0绘图软件进行处理。数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），事后两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度的FA对小鼠C2C12成肌细胞活力的影响

小鼠C2C12成肌细胞与不同浓度（0、2.5、5、10和20 μmol/L）的FA共孵育48 h后，与0 μmol/L FA组相比，其余各组的细胞数量明显增多，见图1A。MTT结果显示，2.5、5、10和20 μmol/L FA可显著提高细胞活力（P＜0.05），且10 μmol/L浓度的FA对细胞活力的影响最为显著（P＜0.01），见图1B。

Figure 1.Effect of FA on C2C12 cell viability.A： C2C12 cell growth obseved by phase-contrast microsopy （scale bar=50 μm）；B：the viability of C2C12 cells increased following treatment with various concentrations of FA for 48 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μmol/L group.图1 FA对小鼠C2C12成肌细胞活力的影响

2 不同浓度的FA对小鼠C2C12成肌细胞增殖的影响

EdU染色阳性细胞为红色，蓝色代表细胞核。EdU检测结果显示，与0 μmol/L FA组相比，其余各组细胞EdU阳性细胞率均显著增加（P＜0.05），且以10 μmol/L FA组EdU阳性细胞率增加最为显著（P＜0.01），见图2。因此后续实验中选择使用10 μmol/L作为FA的浓度。

Figure 2.Effect of FA on the proliferation of C2C12 cells.EdU staining of C2C12 cells after treatment with various concentrations of FA for 48 h （scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μmol/L group.图2 FA对小鼠C2C12成肌细胞增殖的影响

3 FA对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响

MyoD阳性细胞和MyoG阳性细胞为绿色，蓝色代表细胞核。免疫荧光结果显示，在分化的第2天和第4天，与Ctrl组相比，FA组MyoD和MyoG的阳性细胞数均显著增加（P＜0.05），见图3A和图4A。Western blot检测各组细胞MyoD和MyoG蛋白表达量，结果与上述免疫荧光结果一致，见图3B和图4B。

Figure 3.Effect of FA on MyoD expression in C2C12 cells.A： immunofluorescence staining of MyoD in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days （scale bar=50 μm）；B： Western blot analysis of MyoD expression in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Ctrl group （day 2）；#P＜0.05 vs Ctrl group（day 4）.图3 FA对小鼠C2C12成肌细胞MyoD表达的影响

Figure 4.Effect of FA on MyoG expression in C2C12 cells.A： immunofluorescence staining of MyoG in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days （scale bar=50 μm）；B： Western blot analysis of MyoG expression in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Ctrl group （Day 2）；#P＜0.05 vs Ctrl group（Day 4）.图4 FA对小鼠C2C12成肌细胞MyoG表达的影响

4 FA对小鼠C2C12成肌细胞肌管形成的影响

MyHC阳性细胞为绿色，蓝色代表细胞核。免疫荧光结果显示，在分化的第2天和第4天，与Ctrl组相比，FA组MyHC阳性细胞核数与总细胞核数的比值均显著增加（P＜0.05），融合指数显著增加（P＜0.05或P＜0.01），见图5A、B。Western blot结果与免疫荧光结果一致，见图5C。

Figure 5.Effect of FA on myotube formation in C2C12 cells.A： immunofluorescence staining of MyHC in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L） for 2 or 4 days （scale bar=50 μm）， and the ratio of MyHC+ nuclei/total nuclei；B： quantitative results of fusion index；C： Western blot analysis of MyHC expression in C2C12 cells after treatment with FA （10 μmol/L）for 2 or 4 days.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Ctrl group （day 2）；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs Ctrl group （day 4）.图5 FA对小鼠C2C12成肌细胞肌管形成的影响

5 FA对小鼠C2C12成肌细胞JNK/p38信号通路的影响

Western blot结果显示，与0 h组相比，FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38/p38比值均显著增加（P＜0.05或P＜0.01），且随着处理时间的延长，p-JNK/JNK和p-p38/p38比值呈现逐渐增加的趋势，见图6。

6 JNK/p38信号通路在FA促进小鼠C2C12成肌细胞分化过程中的作用

MTT结果显示，FA组细胞活力较Ctrl组显著提高（P＜0.01），SP600125组和SB203580组细胞活力与Ctrl组相比差异均无统计学显著性（P＞0.05）；与FA组相比，FA+SP600125组和FA+SB203580组细胞活力显著降低（P＜0.01），见图7A。Western blot结果显示，与Ctrl组相比，FA组p-JNK/JNK比值和MyHC表达均显著增加（P＜0.01）；与FA组相比，FA+SP600125组p-JNK/JNK比值和MyHC表达均显著降低（P＜0.05），见图7B。另外，与Ctrl组相比，FA组p-p38/p38比值和MyHC表达均显著增加（P＜0.01）；与FA组相比，FA+SB203580组p-p38/p38比值和MyHC表达均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），见图7C。

Figure 7.The role of FA in promoting the differentiation of C2C12 cells through involvement in the JNK/p38 signaling pathway.The C2C12 cells were treated with SP600125 （10 μmol/L；a specific inhibitor of JNK） or SB203580 （10 μmol/L；a specific inhibitor of p38） alone or in combination with FA （10 μmol/L） for 24 h.A： the viability of C2C12 cells was assessed by MTT assay；B： the levels of p-JNK， JNK and MyHC in C2C12 cells were detected by Western blot；C： the levels of p-p38，p38 and MyHC in C2C12 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Ctrl group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs FA group.图7 JNK/p38信号通路参与FA促进小鼠C2C12成肌细胞分化的过程

讨 论

骨骼肌细胞的分化是一个高度组织化的过程，涉及细胞周期的退出、肌管特异性基因的表达和细胞融合形成多核肌管等［11-12］，受生肌调节因子家族和肌细胞增强因子-2家族的控制［13］。其中MyoD和MyoG对于成肌细胞的分化是必不可少的，MyoD主要在肌分化的早期起作用，决定肌原性的命运，如果MyoD缺失或者表达降低，成肌细胞的分化就会停止［14］。MyoG主要在肌分化的的后期起作用，以控制成肌细胞的分化、肌管融合和肌纤维的形成［15］。因此，对MyoD和MyoG检测可直接反映成肌细胞的分化情况。在本研究中，FA显著提高了C2C12成肌细胞MyoD和MyoG的表达，表明FA可以促进C2C12成肌细胞的分化。本研究结果还显示，与分化第2天相比，分化第4天MyoD的表达显著降低，而MyoG的表达显著增加，进一步明确了MyoD和MyoG在分化不同阶段的作用。

成肌分化至成熟的肌纤维的一个关键步骤是成肌细胞融合产生多核肌管［16］。一般来说，MyHC+的细胞代表分化的成肌细胞，融合指数代表融合的多核肌管。对于上述指标的检测可直接反映成肌细胞的肌管形成情况。在本研究中，FA显著提高了My-HC+细胞核占总细胞核的比值和融合指数，表明FA可以促进C2C12成肌细胞肌管的形成。

JNK和p38是MAPK信号通路家族的主要成员，在骨骼肌发育过程中发挥重要的调控作用［17］。关于JNK在调节骨骼肌分化中的作用研究一直存在争议。有研究报道JNK的活性在C2C12成肌细胞分化过程中被激活［18］，也有研究表明JNK的激活参与了表皮生长因子对骨形态发生蛋白诱导的成骨细胞分化的抑制作用［19］。炎症条件下，p38被激活并参与骨骼肌蛋白降解的最终过程［20］。而在基础或健康条件下，p38也被证明在骨骼肌细胞分化中具有积极作用［20］。本研究结果显示，FA处理后，C2C12成肌细胞的JNK和p38的磷酸化水平以时间依赖方式升高，表明FA可以激活JNK/p38信号通路。

为了进一步验证JNK/p38信号通路在C2C12成肌细胞分化过程中的作用，本研究在细胞分化阶段，加入JNK抑制剂SP600125或p38抑制剂SB203580。结果显示SP600125和SB203580单独使用时对细胞活力基本没有影响，而各自与FA联合使用时则会降低细胞活力。另外，FA对JNK和p38的激活以及对C2C12成肌细胞的促分化作用可以被SP600125或SB203580抑制。提示FA可以通过激活JNK/p38信号通路促进C2C12成肌细胞分化。

综上所述，本研究的结果初步表明FA可以通过激活JNK/p38信号通路促进C2C12成肌细胞分化，这为了解FA改善骨骼肌功能的作用机制提供了实验参考。但FA怎样作用于JNK/p38信号通路以及是否影响分化相关的其他信号通路，这些具体的分子机制仍不清楚，尚待深入研究。