急、慢性肾损伤患者血清中生物标志物的研究与验证*

丁 璐， 刘 胜， 胡 波

（中山大学附属第三医院检验科，广东 广州 510000）

急性肾损伤（acute kidney injury， AKI）是由各种原因引起的肾功能在短时间内突然下降而出现的临床综合征。临床表现为肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate， eGFR）下降，血清肌酐（serum creatinine， SCr）和尿素（Urea）等在体内潴留，水电解质和酸碱平衡紊乱等，是威胁患者生命的常见疾病。AKI是住院患者中常见的并发症，AKI可发展成为急性肾功能衰竭（acute renal failure， ARF），死亡率高达26.5%～45.0%［1］。慢性肾脏病（chronic kidney disease， CKD）是由各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，最终发展成为慢性肾功能衰竭［2］。CKD是严重危害人类健康和生命的常见疾病，全球平均患病率约13.4%［3］。据我国第六次全国人口普查结果显示，我国18岁以上成年人CKD的患病率为8.2%［4］。到2040年，估计CKD将成为全球第五大常见死亡原因［5］。

目前，临床上常用SCr、尿量等标志物水平评估肾功能，但肾损伤是亚临床状态向完全衰竭转变的一个连续发展过程，这些标志物在肾损伤早期改变不明显，一般SCr在肾脏功能下降50%以上才会发生明显改变，且容易受到其他因素影响［6］。因此，找到一种特异的、敏感的早期生物标志物对于肾损伤患者极其重要。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）是一种由肾小管上皮细胞合成的与抗菌特性或细胞凋亡相关的糖基化蛋白，可以促进肾小管上皮细胞的分化和组织构成［7-8］。大量研究发现，NGAL作为肾功能损伤的生物标志物，已证实是AKI的早期诊断因子。有研究者利用FVB/N小鼠模型诱导其发生肾脏改变，研究发现，NGAL不仅是急性肾损伤的早期预测因子，也在慢性肾脏病中起着重要作用。本研究通过检测急、慢性肾损伤患者血清中NGAL及各项生物指标水平，探讨各单项指标在急、慢性肾损伤诊断中的作用与价值。

材料和方法

1 一般资料

研究选取2022年1月～2023年7月在中山大学附属第三医院收治治疗的急性肾损伤患者171例作为AKI组，慢性肾损伤患者209例作为CKD组，另选取同期体检的94例健康人员作为对照组，记录3组研究对象性别、年龄等一般资料。

诊断标准：急性肾损伤组：目前临床使用的AKI诊断标准是由2012年国际改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease： Improving Global Outcomes， KDIGO）制定的。根据KDIGO标准的定义，患者SCr 48 h内升高≥26.5 umol/L，或7 d内SCr升高≥1.5倍基础SCr，或尿量减少（＜0.5 mL·kg-1·h-1，持续6 h）即可诊断为AKI［9］；慢性肾脏病组：目前临床使用的CKD诊断标准是由2000年美国国家肾脏基金会（National Kidney Fondation，NKF）修订的最新KDOQI（Kidney Disease Outcome Quality Initiative）指南。根据KDOQI标准的定义：（1）为肾脏损害（血成分、尿成分异常或影像学、病理检查异常）≥3个月，伴或不伴肾小球滤过率异常；（2）eGFR＜60 mL·min-1·1.73 m-2≥3个月，有或无肾脏损伤证据，以上2条中有1条即可诊断为CKD［10］。

纳入标准：（1）符合上述急、慢性肾损伤诊断标准，且SCr≥120 μmol/L；（2）年龄≥18周岁，无严重心功能不全、冠心病、肝脏疾病等重大器官疾病；（3）临床资料完整。

排除标准：（1）妊娠或哺乳期女性；（2）既往肾脏疾病史；（3）心肺功能异常、合并肿瘤、精神性疾病；（4）年龄＜18周岁；（5）其他系统严重疾病；（6）临床资料不完整。本研究经医院伦理委员会批准［批件号：中大附三医伦RG2023-169-01］。

2 收集资料及标本检测

2.1 标本收集 收集患者干燥管静脉血3 mL，采血1 h内将血液以1 369.6×g离心10 min，取血清于干净无菌EP管中，-80 ℃冰箱低温保存。

2.2 收集资料 按照设计的临床登记表收集资料，记录所有纳入对象的相关临床资料和实验室指标，包括年龄、性别、钾（K）、钠（Na）、氯（Cl）、二氧化碳（carbon dioxide，CO2）、尿素（Urea）和葡萄糖（glucose， GLU），所有检查均在本院检验科完成。

2.3 标本检测 所有标本使用HITACHI系列全自动生化分析仪和迈克生物股份有限公司试剂盒，严格按照试剂盒说明书，采用胶乳免疫比浊法检测血清中NGAL水平。

3 统计学处理

将收集的数据系统性录入SPSS 26.0软件并进行相关数据分析，计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）［median （Q1，Q3）］表示，3组间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用采用多因素logistic回归方程分别分析AKI和CKD的相关因素，并依据各指标的预测界值建立联合检测因子，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲线评价检测指标单独及联合检测在AKI和CKD诊断中的意义，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 生物信息学分析

我们通过转录组和蛋白组数据分析发现，在急性肾损伤患者血清中差异显著蛋白和慢性肾损伤患者活体标本中差异显著基因共有的差异数为124（图1A）。这124个差异基因在慢性肾损伤患者活体标本中差异水平见图1B。差异基因的GO富集分析结果显示，排在前列的通路为抗菌免疫反应、嗜中性粒细胞脱颗粒（图1C）。在肾损伤中，嗜中性粒细胞脱落会产生细胞因子破坏肾组织生长，脱落的细胞还会引起炎症反应，进而加剧肾损伤。研究表明，嗜中性粒细胞脱落与NGAL的释放密切相关。在筛选的共有显著基因中，我们发现NGAL位列其中，且显著上调（图1D）。进一步，我们在肾损伤的动物模型上也发现，肾损伤的组织中NGAL水平显著高于假手术组（图1E）。上述结果提示，NGAL可能是肾损伤的检测标志物。

Figure 1.Transcriptome analysis of biopsy specimens from patients with acute and chronic kidney injury.A： Wayn diagram showing the intersection of differentially significant proteins in serum of patients with acute kidney injury and differentially significant genes obtained from sequencing in patients with chronic kidney injury；B： heatmap showing shared significantly differential genes in the discovery cohort and validation cohort of patients with chronic kidney injury；C： GO enrichment analysis of shared significantly divergent genes；D： volcano plot of shared significantly divergent genes；E： Ngal gene changes in mouse kidney tissue in a model of acute kidney injury， **P＜0.01.图1 急、慢性肾损伤患者活检标本转录组分析

2 AKI组和CKD组一般资料比较

AKI组、CKD组和健康对照组，K、Na、Cl、CO2、Urea、GLU、NGAL检测结果对比见表1。AKI组和CKD组K、Na、CO2、Urea、GLU、NGAL水平与健康对照组比较均呈显著性差异（P＜0.05）；各组间年龄、性别和Cl水平比较无统计学差异（P＞0.05）。AKI组和CKD组Urea和NGAL水平明显高于健康对照组（P＜0.05）。

表1 各组实验室指标检测结果差异性分析Table 1.Analysis of the difference of laboratory indexes in each group ［Median （Q1， Q3）］

3 AKI和CKD相关因素的多因素logistic回归分析

logistic回归分析显示，在AKI组中Na［OR=0.692， （95% CI： 0.559， 0.855）］、Urea［OR=4.030，（95% CI： 2.506， 6.482）］、GLU［OR=2.478， （95%CI： 1.288， 4.766）］和NGAL［OR=1.011， （95% CI：1.004， 1.019）］是影响AKI发生的独立危险因素（P＜0.05）；在CKD组中，Na［OR=0.712， （95% CI：0.575， 0.881）］、Urea［OR=4.218， （95% CI： 2.622，6.784）］、GLU［OR=2.038， （95% CI： 1.059，3.921）］和NGAL［OR=1.012， （95% CI： 1.005，1.020）］是影响CKD发生的独立危险因素（P＜0.05），见表2。

表2 发生AKI和CKD时多因素logistic回归分析参数估计值Table 2.Multivariate logistic regression analysis of parameter estimates of AKI and CKD

4 Na、Urea、GLU和NGAL分别在诊断AKI和CKD时的效能

ROC曲线分析结果显示，在诊断AKI发生的曲线下面积分别为：Na［AUC=0.711， （95% CI： 0.773，0.650），P＜0.01］、Urea［AUC=0.960， （95% CI：0.938，0.982），P＜0.01］、GLU［AUC=0.793， （95%CI： 0.738， 0.847），P＜0.01］和NGAL［AUC=0.841，（95% CI： 0.793， 0.888），P＜0.01］，见图2及表3。

表3 Na/Urea/GLU/NGAL在诊断AKI时的效能Table 3.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of AKI

Figure 2.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of AKI.图2 Na/Urea/GLU/NGAL在诊断AKI时的效能

在诊断CKD发生的曲线下面积分别为：Na［AUC=0.681， （95% CI： 0.617， 0.744），P＜0.01］、Urea［AUC=0.990， （95% CI： 0.981， 0.999），P＜0.00］、GLU［AUC=0.703， （95% CI： 0.646，0.760），P＜0.01］和NGAL［AUC=0.930， （95% CI：0.902， 0.958），P＜0.01］，见图3及表4。

表4 Na/Urea/GLU/NGAL在诊断CKD时的效能Table 4.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of CKD

Figure 3.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of CKD.图3 Na/Urea/GLU/NGAL在诊断CKD时的效能

5 NGAL和Urea联合诊断AKI和CKD的效能

ROC曲线分析结果显示，NGAL和Urea联合检测AKI患者发生的灵敏度和特异性分别为81.9%和61.1%［ROC=0.731 （95% CI： 0.685， 0.776）］；NGAL和Urea联合检测CKD患者发生的灵敏度和特异性分别为62.7%和80.0%［ROC=0.794 （95% CI：0.755， 0.833）］，见图4及表5。

表5 Urea和NGAL联合诊断AKI和CKD时的效能Table 5.Efficacy of Urea combined NGAL in diagnosis of AKI and CKD

讨 论

生物标志物是能较准确地反映疾病的发生和发展过程，并能客观地被测量和评价的标志。作为能预测疾病发生的标志物，影响因素少、稳定性高、标本易获得极为重要。Urea、Na、GLU和NGAL均可以通过重复抽取静脉血进行检测，具有方便的优势。Urea是传统的评价肾功能的指标。但研究表明，肾脏的代偿、储备和修复能力比较强，在肾损伤早期，肾脏功能和结构都不会发生改变，可以逆转血流动力学损害，肾功能会得到很好的恢复［11］。当肾小球滤过率降幅＞50%，用于评价肾损伤的生物标志物Urea才会开始升高［12］。有研究显示，Na水平较高会通过有机酸、嘌呤和氨基酸代谢等途径使肾脏皮质和实质发生改变，还会增强糖酵解，引起磷酸戊糖途径、还原型辅酶Ⅱ/氧化型辅酶Ⅱ等活性上调，改变肾脏功能［13］。因此，Na不仅对肾损伤有一定诊断价值，也作为危险因素加重肾损伤，在临床上应该受到重视。血糖是各类并发症的独立危险因素［14］，有研究发现，血糖急性增高可诱导肾小管上皮细胞凋亡，且肾小球过滤的葡萄糖超过肾小管的重吸收能力，加重肾损伤［15］，但影响血糖因素包括遗传、饮食、身体代谢能力等。

NGAL是一种在活化中性粒细胞中被发现的载脂蛋白，生理状态下在肾组织中表达水平极低，可在肾小球自有滤过并在肾小管大量吸收［16］。当接触肾毒性物质或发生肾损伤后，皮质肾小管、血液和尿液中会大量蓄积NGAL，在损伤3 h后便可以检测到，NGAL是肾损伤后最先表达的蛋白质之一，其敏感性明显高于Urea和Cr等传统肾损伤标志物［17］。有研究表明，NGAL对早期诊断急性肾损伤和其肾脏转归具有预测作用［18-19］。还有相关研究表明，NGAL在预测CKD的进展中也有作用［20］。

良好的生物学标志物能及时、准确、客观地作为检测或评价肾功能的指标，并且有助于反映疾病的发生和发展，标本易获取，干扰因素少，稳定性好的指标尤为重要。综上所述，血清NGAL和Urea联合早期诊断AKI和CKD效能较好，检测外周血NGAL和Urea水平是较易获取的患者数据，有助于提升AKI和CKD早期诊断。本研究存在一定的局限性，本研究为单中心研究，研究结果不一定能代表其他地区，后期需要开展多中心研究，并且增大样本量进一步佐证。