献血者使用HIV 抗病毒治疗药物对血液安全的影响

王立林 赵方 杨峥嵘 朱蕊 刘宜仲 邬林枫 李彤 陈婷婷 曾劲峰

(1.深圳市血液中心，广东 深圳 518035；2.深圳市第三人民医院；3.深圳市疾病预防控制中心；4.深圳市宝安区中心血站)

艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是1 种严重威胁人民健康，社会影响重大的性传播病毒。 国家疾控中心发布，截至2022 年9月底，我国报告121.5 万人感染HIV，累计死亡40.8万人。 2010—2017 年中国无偿献血者HIV 感染率Meta 分析结果显示，献血人群中HIV 阳性率约为21.02/10 万人[1]。 另有研究对中国5 个不同地区HIV 流行率进行统计，首次献血者的HIV 阳性率约为37.93/10 万人，重复献血者为20.55/10 万人[2]。近年，欧美等发达国家在献血人群中发现有正在接受HIV 抗病毒治疗(antiretrovital therapy， ART)和正在进行暴露前预防措施(pre-exposure pro，PrEP)的情况[3-4]。 多项临床试验结果显示，献血者中ART 现象涉及面比之前想象的更广泛[5-9]。ART 和PrEP 等HIV 治疗药物应用增加了献血者HIV 筛查的不确定性和风险性，给血液安全带来潜在风险。 ART 治疗后HIV 感染者血浆病毒载量、抗原水平可降至检出限以下，第二代、第三代和第四代酶联免疫吸附试验(ELISA)筛查以及免疫印迹分析(WB)观察到HIV 特异性抗体血清学转化失败和血清学逆转——之前血浆中检测到的HIV抗体消失[10-11]。 使用ART 药物的献血人群，可能会由于HIV 病毒、抗原、抗体均检测不到而导致漏检；使用PrEP 药物预防HIV 感染的人群，也有可能在不知不觉中感染HIV(也称为“PrEP 突破感染”)，用药时体内病毒核酸、抗体难以检测，这些都给HIV 血液筛查及确证带来新的挑战。 本研究应用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法，检测2019—2023 年约从44 万献血者中收集的血浆标本，首次监测我国献血人群中正在接受ART和正在进行PrEP 预防HIV 的实际情况，评估HIV抗病毒药物使用对血液安全影响，为应对HIV 诊疗新趋势带来的输血安全威胁提供基础数据，为献血招募工作识别高危人群提供需要关注的征询内容。

1 材料与方法

1.1 标本分组

1.1.1 阴性对照组

为探明阴性对照组ART 药物血浆基线浓度，随机选取2019—2023 年86 名定期献血者作为阴性对照组。

1.1.2 HIV 实验组

2019—2023 年，从深圳市血液中心44 万献血者中筛查出98 名抗-HIV 阳性者，其标本送检深圳市疾病预防控制中心进行确证实验，后续共同进行血液安全相关研究。

1.1.3 标本保存和知情同意

EDTA-2K 管采集全血， 血浆分装冻存于-80℃。 研究对象均于献血前签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 血液筛查

第四代Genscreen ULTRA-HIV Ag-Ab 试剂(Genscreen ULTRA，美国伯乐):抗-HIV-A，批号:8F0436，9E0465，0G0499；第三代抗-HIV 试剂(北京万泰):抗-HIV-B，批号:I20200103。 人类免疫缺陷病毒(HIV 1＋2 型)抗体检测免疫印迹法(Western blotting，WB)试剂HIV BLOT 2.2(MP 生物医学亚太私人有限公司，新加坡)。 进口试剂(DiaSorin S.p.A.UK Branch): 抗-TP-A， 批号: D972010，D798110；国产抗-TP 试剂(珠海丽珠):抗-TP-B，批号:2019112308，2020061008。 人类免疫缺陷病毒(HIV 1＋2 型)抗体检测免疫印迹法试剂盒(Western blotting，WB)HIV BLOT 2.2(MP 生物医学亚太私人有限公司，新加坡)。 HIV-1 病毒RNA 定量检测试剂盒(Roche COBAS AmpliPrep/COBAS Taq-Man HIV-1，美国罗氏)。 Procleix Panther System 全自动核酸检检测系统(Grifols，西班牙)，使用配套Procleix Ultrio Elite 联检试剂， Procleix HIV-1、HCV、HBV Discriminatory Assay 鉴别试剂(Grifols，西班牙)。 AutoBlot System 20 全自动免疫蛋白印迹仪(美国伯乐)；FACS Calibur 标准流式细胞仪测(BD Biosciences，San Jose，CA，美国)。 高速台式离心机(德国Eppendorf)。

1.2.2 HPLC-MS/MS 检测

Calquant-S LC/MS/MS 系统，多管涡旋混合仪(IKA)，医用高速冷冻离心机，甲酸、甲醇、乙腈(Sigma-Aldrich)，抗-HIV 药物标准品(上海蓝木化工有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 酶联免疫吸附测定判定规则

根据试剂说明书操作和判定结果。 所有标本应用3 遍ELISA，若2 遍及以上反应性判定为阳性，否则结果为阴性。

1.3.2 HIV RNA 核酸单标本检测

标本定性检测献血者血浆中的HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA。

1.3.3 HIV WB 实验判定规则

HIV 阳性献血者，进一步做HIV WB 实验，根据试剂说明书判定标准，没有病毒特异带或者只有p17 带判为阴性；检出2 条ENV 带(gpl60/gp41 和gpl20)及核心蛋白(GAG，包括p17、p24、p55)或酶蛋白(POL，包括p31、p51、p66)判为HIV-1 阳性；出现任何特异条带，但不足以被判断为阳性判为不确定。

1.3.4 HPLC-MS/MS 检测ART 药物

1.3.4.1 标本前处理

在血浆标本中加入含有同位素内标的蛋白沉淀剂，充分涡旋混匀后离心，去上清液稀释后上机检测。

1.3.4.2 标本检测

采用CalQuant-S LC/MS/MS 系统对各组血浆标本中8 项ART 药物(阿巴卡韦、依非韦伦、拉米夫定、洛匹那韦、奈维拉平、利托那韦、替诺福韦、齐多夫定)进行检测，应用Analyst1.6.2 软件进行数据采集，Multiquant 软件进行定量分析。 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，方式多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM) 扫描模式。 离子对信息详情:-1 位定量离子对，-2 位定性离子对。 流动相A:0.2%甲酸水；流动相B:0.2%甲酸，甲醇；梯度洗脱6 min。

1.3.5 献血者中抗-HIV 阳性人群中使用ART 流行率的计算

HPLC-MS/MS 检测抗-HIV 阳性组ART 药物阳性例数占比抗-HIV 阳性组总人数即为使用ART流行率。

2 结果

2.1 各组一般情况及检测结果见表1。

表1 各组一般情况及检测结果(n，%)Table 1 Comparison of the general characteristics and test results within each group(n，%)

2.2 HPLC-MS/MS 检测ART 药物标准品血浆浓度的线性区间

在同一HPLC-MS/MS 检测体系下，8 种ART药物标准品血浆浓度线性区间范围相差较大，替诺福韦标准品可检测浓度最低，为4.0 ng/mL；洛匹那韦标准品可检测浓度最高，为30 000.0 ng/mL。 8种药物检出线性范围见图1。

2.3 阴性对照组献血者使用ART 药物情况

86 例阴性对照组以1 ∶2人份混样，所有标本未检测到基线浓度ART 药物。

2.4 抗-HIV 阳性者使用ART 药物情况

2019—2023 年，深圳市44 万献血者中，98 例抗-HIV 阳性者血浆标本1 ∶2人份混样，发现4 例混样标本ART 药物阳性，拆分检测后确证4 例(编号为I1，I2，I3，I4)ART 药物阳性者，其中，2 例检出ART 药物替诺福韦、拉米夫定、依非韦伦，1 例检出拉米夫定、依非韦伦，1 例检出拉米夫定、洛匹那韦、利托那韦、齐多夫定4 种药物，4 人血浆8 种药物浓度见表2。 抗-HIV 阳性者使用ART 药物阳性率为4.08%。

表2 4 例抗-HIV 阳性者血浆中检出ART 药物种类及浓度(ng/mL)Table 2 ART drug categories and concentrations in 4 anti-HIV positive individuals(ng/mL)

2.5 4 例抗-HIV 阳性者ART 药物检出阳性的背景信息

4 例ART 药物、抗-HIV 阳性者，抗-HIV-A 和抗-HIV-B，WB 结果均为阳性；编号I2 标本抗-TP-A和抗-TP-A 及TPPA 同时阳性，其余I1，I3，I4 均为阴性；I1 标本鉴别试剂HIV RNA 阴性，其余3 例均为阳性(表3)。

表3 4 例检出ART 药物、抗-HIV 阳性者背景信息Table 3 The background information of 4 ART drugs positive/anti-HIV positive individuals

2.6 抗-HIV 阳性者确证结果与是否服用ART 药物关联性分析

5 例确证结果阴性，18 例确证结果不确定的抗-HIV 阳性血浆标本中均未检出ART 药物，本研究中使用ART 药物病例WB 确证试验结果均为阳性(表4)。 其中，1 例WB 确证试验结果阴性、HIV RNA 阳性标本为HIV 窗口期标本；1 例WB 确证试验结果阳性、HIV RNA 阴性标本为服用ART 药物献血者血浆标本；4 例确证结果不确定的抗-HIV 阳性标本HIV RNA 均阳性，其中I8 为HIV 窗口期标本，I7 为HIV、TP 共感染标本，一般信息见表5。

表4 抗-HIV 阳性者确证结果与服用ART 药物情况分析Table 4 The relationship between HIV antibody confirmatory testing results and ART drug taking in anti-HIV positive blood donors

表5 确证结果不确定的抗-HIV 阳性者一般信息Table 5 The general characteristics of anti-HIV positive blood donor with HIV indeterminate results

3 讨论

ART 药物的广泛应用使得HIV 患者愈后改善，并发症减少，生存质量提高，使获得性免疫缺陷综合征( acquired immune deficiency syndrome，AIDS)成为1 种可防可控的慢性疾病。 我国对所有HIV 阳性患者均提供免费抗病毒治疗药物。 与感染后患者开展治疗不同，PrEP 是在未感染HIV的高危行为人群中使用ART，预防HIV 感染，过去5 年在高收入国家迅速推广。 初步统计截止2019年底，英国有19 500 人，主要是男同性恋者和双性恋者应用PrEP 预防高危行为暴露后感染HIV[4]。PrEP 包括每日口服富马酸替诺福韦酯(TDF)和恩曲他滨(FTC)，2012 年经美国食品药品监督管理局批准投入使用，已被研究证实，可将经性行为感染风险降低至少90%，将经注射吸毒共用针具感染艾滋病风险降低至少74%[12]。 暴露后预防(PEP)和PrEP 服用的药物均属于抗病毒类药物，PEP 需要在HIV 高危暴露后(72 h 内)立即服药28 d。 2 h内服药，最大程度杜绝此类风险[13]。

但是，ART 治疗方法的应用可能会增加HIV经输血传播风险。 在药物作用下，HIV 病毒复制受到抑制，影响HIV 诊断标记物HIV RNA、病毒蛋白及相关抗体的生成及检测，早期开展ART 导致血清学逆转及检测标记物质和量上改变，增加了献血者HIV 筛查的不确定性和风险性。 鉴于血液筛查检测灵敏度的限制，迫切需要了解这一人群的献血比例，调查影响因素，采取干预措施识别高危人群，以减少这种情况[14]。

本研究首先确定了同时检测血浆中8 种抗病毒药物标准品HPLC-MS/MS 混样检测体系的混样人数。 图1 显示，8 种ART 药物标准品血浆浓度线性区间范围相差较大，洛匹那韦标准品最高可检测浓度是替诺福韦标准品最低可检测浓度的7 500倍。 根据预实验数据，同时考虑成本效益及后期对大规模人群ART 药物使用情况调查，本研究后续选择1 ∶2人份混合血浆标本，大于3 种常用ART 药物检测下限的混样稀释倍数。 以1 ∶2人份混样的阴性对照组未检测到基线浓度的ART 药物，再次验证定期献血者是最安全的血液来源[15]。 HIV 实验组混样后拆分确证检出4 例ART 药物标本，检出率为4.08%，低于2020 年报道的美国HIV 阳性献血者ART 药物检出率15.4%[3]，也低于2021 年和2023 年发表的英国团队调查的梅毒确诊呈阳性献血者的检出率6.5%和5.6%[4-5]，考虑与我国抗病毒药物使用开展较晚，深圳志愿、无偿、利他的献血工作开展基础较好有关。 表2 中，本研究实验组3 例检出ART 药物替诺福韦、拉米夫定、依非韦伦，1 例检出拉米夫定、洛匹那韦、利托那韦、齐多夫定，共有6 种药物，检出药物种类多，血药浓度除了I1 齐多夫定和I3 拉米夫定在最低检出限以下，其他几种药物浓度均在线性范围内，替拉依3 种药物浓度与Oluoch[16]等研究中的血药浓度有差别，但差别不大。 具体分析时需考虑血药浓度受每日是否按时服药，服药后检测时间等因素的影响。

抗-HIV 阳性者使用ART 药物后献血对血液安全的威胁主要在于服药期间发生高危行为，献血者不确定是否突破感染但隐瞒高危史、服药史前来献血，由于HIV 窗口期存在，血液筛查试剂对这类标本可能存在漏检风险。 本研究中，HPLC-MS/MS 系统检出的4 名使用ART 药物的抗-HIV 阳性者，抗-HIV-A 和抗-HIV-B，WB 结果均为阳性，I1 标本HIV RNA 鉴别结果阴性，其余3 例均为阳性，说明HIV 患者用药后，抗体试剂检出能力较核酸试剂受到的影响更小，但是，因WB 结果均为阳性，抗体条带完整，提示4 例使用ART 药物献血者不是早期感染后服药，没有发生HIV 突破感染及感染早期治疗后的血清学逆转[14，17]。 表3 中I2 标本抗-TPA 和抗-TP-B 及TPPA 同时阳性，支持既往研究的观点:使用ART 药物包括PrEP、PEP 药物主要集中在具有高危性行为人群[18]。 同时，表3 中I2 病例早在2015 年3 月26 日已由深圳疾病预防控制中心(CDC)出具HIV 确证阳性报告，说明深圳地区抗-HIV 阳性献血者中存在使用ART 药物情况，而且有已知确诊感染病例仍然献血的现象。 因血站信息系统与CDC 信息系统未联网，故而此类人群可能献血，但本文此名患者第1 次献血即被筛查检出，更加凸显血液筛查的必要性和有效性。 表3中，4 位服药献血者因未打通电话等原因，无法追踪问询，但推测可能存在以体检为目的献血，也不排除恶意献血等极端行为。

由于本研究检测药物种类有限，并未囊括所有ART 药物，各组是否存在服用其他ART 药物尚未检出情况，研究者将继续展开研究。 根据《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》(WS293-2019)版针对HIV 感染后ART 新的诊疗趋势，增加HIV 核酸定性或定量检测结果与WB 结果一样，都可作为HIV感染的诊断依据。 表4 结合抗-HIV 阳性人群中WB 和HIV RNA 结果，分析这2 种检测方法对服用ART 药物标本的检测能力。 引起研究者注意的是，除了使用ART 药物病例WB 确证试验结果均为阳性，还发现1 例WB 确证试验结果阴性，抗-HIV 阴性，HIV RNA 阳性标本，也即HIV 窗口期标本；发现1 例WB 确证试验结果阳性，HIV RNA 阴性标本，也即服用ART 药物后前来献血的标本。 更需要关注的是表5 中4 例确证结果不确定的抗-HIV阳性标本，HIV RNA 均阳性，其中I8 为HIV 窗口期标本，I7 为HIV、TP 共感染标本，年轻男性，无法联系随访，既往献血2 次，多方面因素提示不确定结果中有可能包括HIV 感染者，或是早期感染WB 抗体条带种类尚未完全产生，或是服用ART 药物WB抗体条带种类产生受抑制，导致出现不确定结果。遗憾的是缺乏随访信息以及更多药物检测结果，我们未能明确这些献血者服药情况。 本文数据及既往研究证实，现有血液筛查检测方法可以检出确定服药及可能服药的抗-HIV 阳性者，但抗-HIV 阴性献血者中是否存在服用ART 药物但尚未突破感染的情况，需要检测更多阴性对照人群血浆是否存在ART 药物，明确PrEP 在献血人群中的应用情况[19]。

目前，国内外多项临床试验中暴露前预防有效性和安全性已得以验证[20-22]。 虽然PrEP 药物在我国获批上市较晚，但部分经济发达城市已经试点使用。 研究调查显示，我国2021 年男男性行为者(MSM)的PrEP 相关知识知晓水平较2019 年大幅增高[23]，应采取综合性措施加强对献血者中MSM人群关于PrEP 对血液安全影响的宣教。 面对ART药物使用所带来的输血风险，献血招募人员也应及时调整高危风险问询内容，采取积极应对措施。

作为采供血机构，为更加从容应对HIV 诊断治疗新趋势带来的挑战，需要及时评估ART 药物使用对血液安全的影响，在献血招募过程中增加问卷调查内容，同时加强科普和法制宣传教育，最大程度上减少HIV 高危人群给血液安全带来的风险。