去除雷达木干扰输血相容性检测的方法及输血疗效评估对比

张警丹 孙佳丽 杜瑞辉 李鹏 孙丽妲 李强

[1.中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)，血液与健康全国重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，细胞生态海河实验室，天津 300020；2.天津医学健康研究院]

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是1 种起源于患者骨髓，浆细胞克隆性增殖的血液系统恶性肿瘤[1]。 CD38 分子是1 种单链Ⅱ型跨膜糖蛋白，在包括MM 在内的血液恶性肿瘤中广泛高表达[2]，因此CD38 分子被当做治疗MM 的靶点[3]。2019 年7 月，雷达木作为第1 款抗-CD38 单克隆抗体[4]在我国上市，其已被《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020 年修订)》推荐为治疗复发难治性MM的治疗药物[5-6]。 CD38 抗原广泛表达，RBC 上也有表达，尽管水平较低，雷达木单抗与RBC 表面CD38 抗原的结合仍会在间接抗人球蛋白试验(indirect antiglobulin test， IAT)中产生泛凝集，并导致抗体筛查和交叉配血结果阳性[7-8]。 因此经DARA治疗后的MM 患者输血相容性检测需使用特殊的配血策略。

血液与生物治疗促进协会(Association for the Advancement for Blood ＆ Biotherapies，AABB)非紧急情况下推荐使用经DTT 处理过的RBC 与患者血清进行试验，因为DTT 可使RBC 表面CD38 变性从而阻止其结合抗体，这是目前国际上消除CD38单抗干扰的最常用方法[9-10]。 但DTT 处理RBC 后虽然不影响A、B 抗原，Rh 系统抗原及部分其它系统抗原，却会影响K、k、LWa、Ytb 等抗原[11-12]，造成相对应抗体的漏检。 Egon 等[13]使用木瓜蛋白酶的Fab 试剂盒将DARA 裂解为DARA-Fab 片段，该片段可与RBC 表面CD38 抗原结合，此法可在不漏检抗体的前提下解决DARA 对MM 患者的输血相容性检测干扰。 本研究通过比较2 种处理方式患者输血前后的Hb、TBil、DBIL 和I-Bil 值，统计分析2种方法的差异性，验证DARA-Fab 处理方法的可行性和有效性，评估该方法输血疗效，为解决DARA干扰输血相容性检测提供1 种新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2023 年2 月—7 月在本院就诊的20 名MM 患者，其中男性13 名，女性7 名，年龄33～70 岁，中位年龄为59 岁，这些患者使用配血方法为DARA-Fab片段中和方法；2019 年9 月—2020 年11 月在本院就诊的20 名MM 患者，其中男性12 名，女性8 名，年龄39～66 岁，中位年龄为57 岁，这些患者均使用DARA 治疗。 2 组一般资料差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 试剂与仪器

PierceFab 制备试剂盒[英潍捷基(上海)，批号44985]；血型血清学离心机(久保田，KA-2200)；样本离心机(北京白洋医疗，BY-150C 型)；抗人球蛋白检测卡专用离心机(达亚美公司，ID-Centrifuge 12SⅡ)；RBC 血型抗筛细胞(西班牙戴安娜，批号22050.01，23003.01，23007.01，23011.01，23016.01，23021.01)， RBC 血型抗体鉴定细胞(批号8000458616，8000458859，80009055)，单克隆试剂抗-M(批号800456495)，单克隆试剂抗-Fyb(批号8000450774)， 单 克 隆 试 剂 抗-Jka( 批 号8000456033 )， 单克隆试 剂 抗-Jkb( 批 号8000457809)， 单克隆试剂抗-Lea( 批号8000451442)， 单克隆试剂抗-Leb( 批号8000455382)，均为荷兰Sanquin 产品；单克隆试剂抗-N(批号994031A)，单克隆试剂抗-S(批号624024)，单克隆试剂抗-K(批号924685)，单克隆试剂抗-Fya(批号618021)，均为Immucor 公司产品；DTT 试剂(德国Roche 公司，批号38225823)；微珠凝胶卡(达亚美公司，批号8044088806)；Rh血型检测卡(江苏力博医药，批号202305005)等。

1.3 方法

1.3.1 DARA-Fab 片段的制备

将250 μL 固定化木瓜蛋白酶溶液置于0.8 mL自旋柱中，并以4 125 g 离心2 min，并弃去缓冲液。将3.5 mg 半胱氨酸盐酸溶解在Fab 消化缓冲液(可提前制备)中，并用0.5 mL 消化缓冲液洗涤，4 125 g 离心2 min。 随后，将200 μL DARA(2 mg)和400 μL 消化缓冲液混合加入到自旋柱中。 37℃孵育16 h，期间需多次混匀。 4 125 g 离心2 min 提取DARA-Fab 片段。 使用100 μL PBS(pH＝7.2)洗涤片段，并最终用100 μL PBS(pH ＝7.2)混合Fab片段置于-20℃储存(可分装，冷冻有效期可至数月)。

1.3.2 不同浓度DARA 对于红细胞输血相容性检测干扰

将50 μL 0.8%细胞和25 μL 标准人血清混合DARA 溶液(浓度分别为500、1 000、1 500、2 000 mg/L)置于管中37℃孵育15 min，孵育期间多次混匀孵育结束后，取红细胞混合液置于微住凝胶卡中，以未加DARA 血清为对照，135 g 离心10 min观察结果。

1.3.3 不同剂量DARA-Fab 片段对于红细胞输血相容性检测的去除效果

将50 μL 0.8%抗筛细胞、25 μL 标准血清混合DARA 溶液(浓度500 mg/L)和不同体积(5、10、15、30 μL)DARA-Fab 片段，共同在在试管中37°C孵育15 min，红细胞被多次搅拌，将整个细胞悬液转移到微柱凝胶卡中，以未加DARA 血清为对照组，在卡式离心机中离心10 min 观察结果。 将15 μL DARA-Fab 片段和50 μL 0.8%抗体鉴定细胞与25 μL 标准血清混合DARA 溶液(浓度500 mg/L)为试验组，未加DARA-Fab 片段为对照组，孵育离心方法与上述3 步骤一致。 未完全中和的部分鉴定细胞，选择30 μL DARA-Fab 片段来孵育离心，观察结果。

1.3.4 DARA-Fab 对红细胞表面抗原的影响

选择抗筛谱中对应抗原阳性的抗筛细胞，吸取50 μL 抗筛细胞与15 μL DARA-Fab 片段加入试管中，并在试验组中加入20 μL 对应的单克隆抗体(抗-M、-N、-S、-Fya、-Fyb、-K、-Jka、-Jkb、-Lea、-Leb)，且组内选取每个系统抗原阴性的抗筛细胞为组内对照，37°C 孵育15 min，以未加15 μL DARA-Fab片段为对照组，将试管中溶液加入微柱凝胶卡中离心查看结果。 吸取50 μL Rh 血型系统中阳性的抗筛细胞与15 μL DARA-Fab 片段加入试管中，37°C孵育15 min，红细胞被多次搅拌，为试验组，以未加15 μL LDARA-Fab 片段为对照组，孵育后加入Rh血型检测卡，离心10 min，观察结果。

1.3.5 DTT 处理供者红细胞的输血相容性检测

操作步骤详见参考文献[14]。

1.3.6 RBC 输注

DARA-Fab 片段组和DTT 组均选择使用交叉配血、抗体筛查试验均为阴性的RBC 给与患者输注，并将患者输注前后1d 的Hb 含量作为输血疗效的重要指标，并记录患者输血前后的TBil、DBIL 和I-Bil。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0 软件进行数据统计学分析，实验室指标值输血前后以“均值±标准差(±s)”表示，采用配对t检验进行统计学检验，P＜0.05 表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度DARA 对于红细胞输血相容性检测的干扰

500、1 000、1 500、2 000 mg/L 浓度的DARA 对于红细胞交叉配血中均有干扰，在微珠凝胶卡中显示均为2 ＋，见图1。 因由文献[15] 报道214、575 μg/mL为给药8、16 mg/kg DARA 后每周给药结束时的平均给药前血清浓度，故后面试验均选用500 mg/L 浓度。

图1 不同浓度DARA 对于红细胞交叉配血的干扰Figure 1 The interference of different concentrations of DARA on RBC cross-matching

2.2 不同剂量DARA-Fab 片段对于红细胞输血相容性检测的去除效果

5、10 μL 的DARA-Fab 片段结果为阳性，15、30 μL结果为阴性，见图2。

图2 不同剂量DARA-Fab 片段对红细胞交叉配血的去除效果Figure 2 The removal effect of different doses of DARAFab fragments on RBC cross-matching

2.3 DARA-Fab 片段处理抗体鉴定细胞的剂量选择

15 μL DARA-Fab 处理抗体鉴定细胞后基本为阴性，但有个别鉴定细胞可能因为CD38 抗原较多，无法完全封闭掉抗原，故又选择1、6、8、10、12号抗体鉴定细胞经30 μL DARA-Fab 片段处理后，结果为完全阴性，见图3。

图3 DARA-Fab 片段处理抗体鉴定细胞的剂量选择Figure 3 Dose selection for DARA-Fab fragment treatment of antibody identification cells

2.4 DARA-Fab 对红细胞表面抗原的影响

DARA-Fab 对MNS 系统、Duffy、Kidd、Kell、Lewis 和Rh 血型系统中的阳性和阴性抗原均无影响，见图4。

图4 DARA-Fab 对红细胞表面抗原的影响Figure 4 The effect of DARA-Fab on RBC surface antigen

2.5 DARA-Fab 片段中和的输血相容性检测方法输血前后实验室指标

输血前后Hb 有明显差异(P＜0.01)，TBil、DBIL 和I-Bil 无明显差异(P＞0.05)，见表1。

Hb(g/L)TBil(μmol/L) DBIL(μmol/L)I-Bil(μmol/L)输血前 63.60±1.5816.25±3.546.31±2.329.94±1.38输血后73.90±1.90∗17.87±3.577.10±2.8010.77±1.22

2.6 2 种配血方法患者输血前后实验室指标差异比较

2 组患者输血前后Hb 值、TBil、DBIL 和I-Bil的差值，P均＞0.05，见表2。

Hb 差值(g/L)TBil 差值(μmol/L)DBIL 差值(μmol/L)I-Bil 差值(μmol/L)DTT 处理方法 10.75±1.04 3.31±1.472.76±1.24 1.97±0.40 Fab 封闭方法10.30±0.98 3.31±0.552.60±0.83 2.82±0.53

3 讨论

DARA 是1 种新型人源IgG1κ 型抗-CD38 单克隆抗体，具有较强的抗MM 活性，可作为单药物治疗MM，也可与其它药物联合使用[2]。 DARA 单抗可靶向结合骨髓瘤细胞表面高表达的CD38 分子，通过多种作用机制(补体依赖细胞毒性、抗体依赖细胞介导的细胞毒性、抗体依赖细胞吞噬和抑制CD38 酶活性)诱导肿瘤细胞死亡，对于治疗复发性难治性MM 有着很好的疗效效果[16]。 随着DARA单抗在我国正式上市，其不仅广泛应用于MM 治疗，也在其它肿瘤治疗中得到应用[16]，但由于DARA 可干扰输血相容性检测，这就需要输血科制定适当的解决方案来应对。

本研究通过Fab 制备的试剂盒，将DARA 裂解为DARA-Fab 片段，该制备方法简单易行，不需要特殊设备。 木瓜蛋白酶可将DARA 分解成2 个Fab 片段和1 个Fc 片段，Pierce Fab 试剂盒使用木瓜蛋白酶(1 种非特异性硫醇内肽酶)固定在琼脂糖树脂上，可以从IgG 中高效地生产Fab。 固定化酶的优势在于可以通过从树脂中去除IgG 溶液来立即停止消化，以免酶的残留影响所得产物，保证产物的纯净不存在剩余酶的干扰。 该试剂盒包括便于操作酶树脂的旋转柱，预包备和固定化的NAb蛋白A、离心柱结合Fc 片段和未消化的IgG。 通过使用试剂盒中的蛋白A 消除Fc 片段将木瓜蛋白酶纯化不是必需的，因为Fc 片段在温育期间不会干扰DARA-Fab 片段和RBC 表面CD38 抗原的结合。与患者血清抗体中IgG 浓度相比，Fc 片段的低量预期不会干扰输血相容性检测中抗原抗体的结合，这也使得DARA-Fab 片段制备更加简易，无需后续步骤来纯化Fab 片段。

在第1 次全剂量使用DARA 后，DARA 的消除半衰期平均为(110±42)h，在第7 次使用16 mg/kg DARA 的情况下，DARA 的消除半衰期平均为(587±487)h[15]。 有报道[17-18]也表明DARA 引起的泛凝集可在MM 患者持续用药6 个月后继续发生。我们采用500、1 000、1 500、2 000 mg/kg 的浓度来测试DARA 对红细胞输血相容性检测的干扰，是由于相关文献[13，15]报道患者在给予DARA 治疗后可出现426～993 mg/L 的较高血清峰浓度。 图1 显示这4 个浓度对于IAT 最终结果均为2 ＋的凝集强度，推测这是由于RBC 表面CD38 抗原的表达数量是有限的，因此DARA 与CD38 抗原凝集强度的上限也就是2＋，故在试验中均采用了500 mg/kg 的血清浓度来代表MM 患者经过DARA 药物治疗后的血清浓度。

随后，为了测试不同剂量DARA-Fab 片段遮蔽红细胞表面CD38 的效率，我们采用了5、10、15、30 μL 的Fab 片段和RBC 与添加DARA 的血清共同孵育离心，结果如图2 显示，15 μL 的Fab 片段可完全与红细胞表面CD38 抗炎结合消除干扰，这与文献报道一致[13]。 此方法使用的是竞争法，是让Fab片段和DARA 竞争性地与RBC 表面CD38 抗原结合，我们先使用Fab 片段与RBC 孵育的封闭法，再使用与血清孵育的方法，这2 种方法均显示15 μL的剂量可将CD38 单抗的干扰完全去除。 因竞争法比封闭法更为简练且节约时间，故后续使用的均采用竞争法。 又考虑到体积增加对红细胞有稀释作用，影响最终反应结果，故我们采用改良的添加体积方案，使得红细胞与血清的浓度不受影响，结果与传统方案结果一致。

为了进一步验证DARA-Fab 的遮蔽作用，我们使用15 μL Fab 与其共同孵育，结果见图3，15 μL Fab 可与大多数抗体鉴定细胞阴性，但仍有部分细胞不能完全遮蔽掉，故又将这部分细胞使用30 μL Fab，结果最终为阴性。 这种现象推测可能与RBC表面CD38 抗原的表达量有关，存在个体差异；在后续配血过程中我们也发现主侧配血时献血者红细胞也需30 μL Dara-Fab 才能完全封闭CD38 抗原，但抗筛细胞只需要15 μL，这一现象也提示红细胞CD38 抗原表达也可能与红细胞的新鲜程度有关。 因抗筛细胞为进口，待我们使用时已经保存较久，而献血者红细胞较为新鲜，这种现象与我们通过流式细胞术检测时发现新鲜红细胞CD38 抗原表达量最高是一致的。 为了保证试验整体设计的一致性，后续试验中我们统一采用30 μL Fab 来去除DARA 的干扰。

我们根据抗筛谱选取对应抗原阳性、阴性的细胞和对应单抗和Fab 片段共同孵育，图4 显示2 组结果一致，这表明DARA-Fab 片段对于红细胞表面血型系统抗原的阳性和阴性表达无影响。 这与它去除干扰方式有关，Fab 片段只与RBC 表面CD38抗原结合，不会干扰其它血型系统抗原的表达。 与DTT 的干预方式完全不同，DTT 能裂解CD38 分子胞外区的二硫键，使得CD38 抗原分子变性来阻止与DARA 结合，但DTT 也会破坏部分血型系统抗原如K[14，19]。 这是DARA-Fab 片段方法的优势所在，使用此方法可不受干扰地对红细胞进行抗体筛查和抗体鉴定，为安全的输血相容性检测提供支持。 为了评估Dara-Fab 片段方法输血疗效，我们将其与DTT 方法的输血效果进行了对比，分别选取2组20 名患者使用Fab 和DTT 方法来进行交叉配血，比较患者输血前后的Hb 和TBil。 如表1 所示，经过统计分析，使用DARA-Fab 方法的配血患者Hb 值有明显的差异，且TBil、DBIL 和I-Bil 无明显差异，这表明患者输血有效且未引起溶血反应。DTT 方法的有效性在我们已发表的文献[14]中具体阐述过，且本次统计中均采用输注2 U 红细胞/人/次，其输血前后红细胞差值均为10 g/L，这与张之南等[20]研究的2 U 的红细胞输注后Hb 增量是一致的，表明红细胞输注的有效性。

随着单克隆抗体治疗的日益普及，输血实验室收到此类血液标本的可能性也随之增加。 DTT 法使用最为普遍，但不易购得，且操作较为繁琐费时，加之有毒还需在通风橱内进行试验。 而DARA-Fab片段可提前制备，且在-20℃下保存较久，需要使用时解冻即可；后续步骤简便，采用卡式方法读取结果即可。 此方法易于标准化，对操作人员要求较低，且不易漏检抗体。 但Fab 试剂盒也与DTT 同属科研试剂，需要相关资质购买，价格和DTT 一样，略高，且DARA-Fab 的制备时间较长，但这仍为解决临床上抗-CD38 单抗干扰输血相容性检测提供了1 种新的方案，保证患者能够得到安全、快速的输血治疗。