RIP1、MLKL蛋白在未分化甲状腺癌中的表达及临床意义

姜 燕, 郭 越, 王 芳, 张 学, 牛彦斌

(山西白求恩医院/山西医学科学院/同济山西医院/山西医科大学第三医院中心手术部, 太原 030032)

未分化甲状腺癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)患者生存预后较差[1-2]。迄今为止,还没有针对此类患者的特异性靶向治疗方法。受体相互作用蛋白激酶1(Receptor interacting protein kinase 1,RIP1)是一种跨膜糖蛋白,在多种恶性肿瘤中都存在过表达,是乳腺癌、肝细胞癌、卵巢癌等恶性肿瘤靶向治疗的理想候选标志物[3-6]。RIP1在食管鳞癌和乳腺癌中的表达与患者预后不良显著相关[7]。

混合系激酶区域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)是RIP1激酶的底物,它的磷酸化修饰也标志着细胞坏死复合体的激活[8]。Husain等[9]研究显示,作为坏死复合体的核心组分,MLKL与程序性细胞坏死的执行密切相关。MLKL在程序性细胞坏死信号通路中的关键作用在于其独特的“膜爆破”机制[10]。在ATC细胞系中,RIP1水平较正常甲状腺上皮细胞系显著升高,因此有研究者认为ATC中RIP1的异常表达与更强的侵袭性生物学行为有关[9]。本研究旨在评估ATC中RIP1、MLKL的免疫组化表达,并探讨其作为ATC诊断和预后指标的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2010年1月至2019年1月山西白求恩医院收治的48例ATC患者为研究对象。纳入标准:(1)均经术后病例确诊为ATC;(2)首次诊断并治疗;(3)行手术切除治疗;(4)手术标本均包括癌旁组织及癌组织;(5)临床资料及随访资料完整。排除标准:(1)院内或出院后30 d内死亡;(2)随访依从性较差;(3)复发性患者。最终48例患者被纳入研究,其中男性26例,平均年龄(53.2±13.2)岁,女性22例,平均年龄(55.2±12.2)岁。在电子病历系统内收集患者临床资料,包括年龄、性别、T分期、N分期、美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)分期等。本研究已获得山西白求恩医院伦理委员会批准(201901014)。

1.2 免疫组织化学染色从HE染色切片中仔细选择一个有代表性的肿瘤区域。在二甲苯和梯度乙醇中脱蜡,热修复抗原,0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶,血清孵育阻断非特异性结合。切片与抗RIP1抗体、抗MLKL抗体共同孵育24 h。将生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标记的亲和素与样品孵育,利用DAB法染色。由两名医生对患者切片进行独立评估。染色强度随机分为4级:0级(无染色)、1级(弱染色)、2级(中度染色)、3级(强染色),阳性细胞百分率分别为0(0%)、1(1%～30%)、2(31%～50%)、3(>50%)。染色阳性的判定公式为:总积分=阳性百分率分数×强度分数。评分为0～2分记为“阴性”,>2分记为“阳性”。

1.3 随访所有患者都通过门诊或电话随访,术后第1年每3个月随访一次,从第2年开始,每6个月随访1次,直至患者死亡或研究结束。总体生存率(overall survival,OS)被定义为从手术之日到死亡或最后一次随访的时间。无病生存期(disease free survival,DFS)定义为:从随机化开始至疾病复发或(因任何原因)死亡之间的时间。通过影像学检查诊断术后复发。所有受试者均对本研究知情同意。

1.4 细胞系人未分化型甲状腺癌 THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101细胞系、分化型甲状腺癌细胞系CAL-62、PDTC-1、正常人甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3均购于美国典型培养物保藏中心。细胞常规培养在添加10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养液或RPMI1640培养基中,在含5%CO2的37℃培养箱中进行孵育。

1.5 Western blot检测细胞用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA),4℃,13 000 r/min离心20 min,用二辛可宁酸(bicin choninic acid,BCA)蛋白测定法测定蛋白质含量。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离蛋白质,并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶阻断非特异性结合90 min。用抗RIP1(1∶2 000)、抗MLKL(1∶1 000)一抗与PVDF膜共同孵育过夜。然后用0.1%的TBST清洗PVDF膜,并与二抗体沟通孵育2 h。ECL化学发光检测试剂盒检测特异性蛋白条带。结果用Quantity One软件进行量化。

1.6 RT-PCR检测提取细胞总RNA,合成cDNA。使用用于SYBR Green和7500快速实时聚合酶链式反应系统进行实时聚合酶链式反应。引进引物序列如下,RIP1:正向5′-TCTGCTGACCTGCT-CCATCTGAC-AAAAC-3′ 和反向5′-GGTGATC-AGTTGTGCTGAGGCTAAT-3′; MLKL: 正向: 5′-ACTGGACCCTGGAAGCACTTTGC-3′和反向5′-GAGTGTTGTACCAGGGGA-3′。所有引物序列均由上海生物工程技术有限公司合成。RT-PCR反应条件如下:95℃预变性10 min,然后95℃变性30 s,50 ℃退火30 s,40个循环,最后70℃延伸10 min结束。

1.7 统计学分析所有数据均采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计数资料采用例(%)表示,组间比较采用卡方检验。生存分析采用Kaplan-Meier法,Log-rank检验比较生存率差异。将单因素生存分析结果差异有统计学意义的因素纳入Cox回归进行多因素分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 未分化甲状腺癌细胞系中RIP1 mRNA、MLKL mRNA相对表达水平RT-PCR检测显示,RIP1 mRNA在正常人甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3、分化型甲状腺癌细胞系CAL-62、PDTC-1、人未分化型甲状腺癌 THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101细胞系的相对表达量分别为(1.0±0.1)、(1.2±0.2)、(1.7±0.4)、(1.6±0.3)、(1.9±0.3)、(2.3±0.5)、(2.4±0.4)、(2.7±0.4)、(3.2±0.5),MLKL mRNA的相对表达量分别为(1.0±0.1)、(1.1±0.1)、(1.5±0.2)、(1.8±0.2)、(1.4±0.2)、(1.8±0.3)、(2.3±0.3)、(2.5±0.3)、(2.7±0.3),与正常人甲状腺细胞系及分化型甲状腺癌细胞系相比,未分化甲状腺癌细胞系中RIP1 mRNA、MLKL mRNA的相对表达水平明显更高,见图1。

图1 不同细胞系中RIP1 mRNA、MLKL mRNA相对表达水平

2.2 未分化甲状腺癌细胞系中RIP1蛋白、MLKL蛋白相对表达水平Western blot检测结果显示,与Nthy-ori 3-1细胞相比,RIP1蛋白在HTORI-3、CAL-62、PDTC-1、 THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101细胞系的相对表达量分别为(1.3±0.1)、(1.4±0.1)、(1.1±0.1)、(1.5±0.2)、(1.8±0.3)、(2.7±0.3)、(2.0±0.2)、(1.8±0.2),MLKL蛋白的相对表达量分别为(1.4±0.2)、(1.3±0.1)、(1.0±0.2)、(1.5±0.2)、(1.7±0.2)、(1.9±0.2)、(1.7±0.2)、(1.8±0.3),与正常人甲状腺细胞系及分化型甲状腺癌细胞系相比,未分化甲状腺癌细胞系中RIP1蛋白、MLKL 蛋白的相对表达水平明显更高。见图2。

图2 不同细胞系中RIP1 蛋白、MLKL 蛋白相对表达水平

2.3 ATC组织学特征48例ATC患者中,14例起源于乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、34例起源于滤泡状甲状腺癌(follictalar thyroid carcinoma,FTC)。ATCs的组织学特征复杂多变,生长特征可表现为弥漫性实性,多灶性坏死和出血融合区。肿瘤细胞表现出明显的多形性。形态学特征包括梭形细胞为主的肉瘤样及鳞状细胞样。起源于PTC成分表现为多种组织学变异,起源于FTC成分表现为以微滤泡为主的生长模式,肿瘤细胞核微增厚。见图3。

图3 ATC组织学特征(×200,HE染色)

2.4 ATC组织中RIP1的免疫组化染色免疫组化染色显示,RIP1表达主要定位于ATC细胞膜。48例ATCs中有24例(50.0%)患者RIP1染色阳性,组织中含有混合岛状或低分化癌成分,而癌旁组织中RIP1阳性率为14.6%(7/48)。见图4。

图4 RIP1在组织中的表达(×200,SP染色)

2.5 MLKL免疫组化染色MLKL阳性细胞核表达清晰,MLKL表达主要定位于肿瘤细胞膜,在细胞质中也有少量表达。48例ATCs中有29例(60.4%)患者MLKL染色阳性,而癌旁组织中MLKL阳性率为16.7%(8/48)。见图5。

图5 MLKL免疫组化染色(×40,SP染色)

2.6 RIP1/MLKL表达对患者总体生存率的影响Kaplan-Meier生存分析显示,RIP1和MLKL的过度表达对ATC患者的DFS有显著的消极影响(χ2=14.52,P<0.05;χ2=7.54,P<0.05),但对患者的总体生存期(Overall survival,OS)无明显影响(χ2=2.74,P=0.152;χ2=1.63,P=0.405)。见图6。

图6 RIP1及MLKL表达对患者总体生存率的影响

2.7 影响患者DFS的Cox多因素分析Cox多因素分析显示,RIP1高表达、MLKL高表达、N分期、M分期均是影响ATC患者DFS独立危险因素(P<0.05)。见表1。

表1 影响患者DFS的Cox多因素分析

3 讨论

ATC是一种罕见但高度恶性的甲状腺肿瘤,约占所有甲状腺癌的1.6%,患者5年生存率不足10%[1]。单一治疗模式对ATC的作用有限,目前常采用积极的多模式综合治疗,尽管如此,ATC患者从诊断到死亡的平均生存时间仍然仅有6个月左右[2,11]。迄今为止,还没有针对此类患者的特异性靶向治疗方法。

RIP1是一种跨膜蛋白,在多种类型的肿瘤膜上均过表达细胞外结构域,且相对于正常细胞表达增加。一些针对RIP1的治疗方法,如抗RIP1抗体和靶向RIP1抗体药物偶联物已被开发应用于临床[12]。Tao等[13]早期临床试验已证明,以RIP1为基础的靶向药在多种类型肿瘤治疗中的安全性和临床效益均较可靠,包括小细胞肺癌、三阴性乳腺癌和铂耐药尿路上皮癌。对于甲状腺肿瘤,Sakr等[14]研究显示,RIP1有助于区分甲状腺良、恶性病变。Kanematsu等[15]一项对组织微阵列进行的研究显示,90%(54/60)的原发性PTC、3.7%(1/27)的FTCs和21.4%(3/14)的ATC为RIP1阳性。本研究中,多数PTC病例表现为RIP1高表达,因此推测PTC可能会从靶向RIP1治疗中受益。此外,本研究结果显示,50%的ATC中RIP1表达阳性,其中6例表现为弥漫性或局灶性鳞状分化或鳞状样特征。ATC是一种高度侵袭性的恶性肿瘤,目前尚无有效的靶向治疗方法。本研究结果表明,RIP1表达上调的ATC患者,可能会从靶向RIP1治疗中获益。特别是具有鳞状改变的ATC患者,由于RIP1在该ATC亚群中持续高表达,该亚群极可能受益于靶向RIP1治疗[16]。RIP1蛋白不仅与肿瘤进展相关,其表达也与肿瘤预后、化疗的耐药密切相关[17]。D′Onofrio等[18]以结直肠癌患者为研究对象,发现与RIP1蛋白低表达患者相比,RIP1蛋白高表达患者普遍有较差的DFS。本研究也有相同发现,且本研究通过Cox多因素分析发现,RIP1高表达是ATC患者DFS的独立危险因素。

MLKL作为癌症发生及进展的表观遗传改变的标志物,已成为诊断和治疗靶点。与正常组织相比,前列腺癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、结肠癌以及黑色素瘤的MLKL表达水平较高[19]。Lai等[20]研究发现,相较于结节性甲状腺肿,PTC中MLKL表达量明显升高。Desai等[21]研究发现,在ATC中,MLKL水平显著升高是恶性肿瘤的表观遗传标志[10]。本研究发现,ATC中MLKL表达水平明显升高,提示MLKL可作为一种诊断ATC的生物标记物。Colbert等[22]提出MLKL是早期可切除胰腺癌患者的生物学预后标记物,其中低MLKL组和高MLKL组患者的总体生存时间分别为16个月和6个月,生存差异有统计学意义(P=0.006)。Li等[23]的研究发现,接受辅助化疗的结肠癌患者中,高MLKL表达的结肠癌患者同样提示生存预后不佳。本研究也发现,MLKL高表达是影响ATC患者DFS独立危险因素。提示MLKL高表达可能是提示ATC患者预后不佳的生物学标记物。

ATC是较为罕见但具侵袭性的甲状腺癌亚型。本研究结果表明,在未分化甲状腺癌细胞系及组织中,RIP1、MLKL表达水平均显著升高,且二者均是影响ATC患者DFS的独立危险因素,二者或可作为ATC潜在的治疗靶点及预后预测的生物学标记物。