辛润宣通法治疗神经病理性疼痛细胞因子的调控机制

侯媛媛，闫咏梅

（陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

神经病理性疼痛是由神经系统功能性异常或器质性损伤引发的常见疼痛类型，临床多表现为慢性疼痛且多合并失眠、抑郁、焦虑等精神障碍，对患者日常生活影响较大[1-2]。目前临床多通过抗惊厥、阿片类、抗抑郁药物等对神经病理性疼痛进行治疗，虽然上述药物可暂时减轻疼痛，但对神经损伤无修复作用，且常引发神经顺应性下降、神经脱髓鞘等副作用，故临床应用具有局限性[3]。中医在多种疼痛性疾病治疗中均有应用，临床经验较为丰富且镇痛效果较佳，而旋覆花汤为辛润宣通法，具有滋润阴血、宣通脉络的作用，在背部疼痛、疗带状疱疹后遗顽固性肋间神经痛等多种疼痛性疾病治疗中均取得较好治疗效果[4]。基于此，本研究分析了辛润宣通法对神经病理性疼痛细胞因子的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取120只SPF级Wistar大鼠，体质量180～220 g，由江西浩然生物制药有限公司提供，动物许可证号：SYXK（赣）2019-0007。所有大鼠在相对湿度、室温分别为50%、23°C的无病原菌笼子中进行5 d适应性喂养，本试验操作均参照动物试验伦理要求的相关规定，且经我院伦理委员会批准同意（伦理编号：20210612）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与建模 大鼠适应性喂养5 d后按照随机数字表法分为假手术组、模型组、旋覆花汤高剂量组、中剂量组及低剂量组、普瑞巴林组，每组各20只，假手术组正常喂养，剩余5组参照刘霞等[5]建立神经病理性疼痛模型，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后将坐骨神经起始处显露，腓总神经、胫神经采用丝线结扎，将腓肠神经保留，以大鼠出现明显舔足及抬足为建模成功。

1.2.2 药物制备及给药 取旋覆花、归尾、茜草、桃仁、柏子仁各10 kg，加600 L水，煮沸后再煎沸60 min，后对药物滤液进行过滤、收集，药渣中再加水500 mL，煮沸后再煎沸60 min，再次收集滤液，将2次收集药液合并，离心15 min（3 cm离心半径，3 000 r·min-1转速），后将离心处理滤液在60℃、-0.06MP压力减压下压缩成32.5 L（生药液浓度为1.54 g·mL-1），保存于4 ℃以下，旋覆花汤高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予10 g·kg-1、5 g·kg-1、2.5 g·kg-1旋覆花汤药液，于术后1 d进行灌胃，每日1次，共15 d，普瑞巴林组在术后1 d给予15 mg·kg-1普瑞巴林药液，每日1次，共15 d，假手术组及模型组同量0.9%氯化钠溶液，每日1次，共15 d。

1.2.3 样本采集 连续干预15 d后，麻醉后横向切开术侧臀股交界处，逐层分离肌肉、筋膜，暴露坐骨神经后，取1 cm坐骨神经，制成标本，-80 ℃保存。

1.3 指标检测

1.3.1 病理学观察 取保存待检大鼠坐骨神经，经脱水、石蜡包埋处理后，做HE染色，光镜下对坐骨神经病理形态变化进行分析。

1.3.2 行为学检测 于用药结束后麻醉处死前对大鼠括自发性疼痛评分、大鼠机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT）、热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency, TWL）水平进行检测。1）自发性疼痛评分检测：将大鼠置于0.45 m×1.2 m×1.2 m的安静格子中，对其自由活动、跛行程度、后肢使用情况进行观察，后爪无畸形、运动正常为0分，后爪明显畸形但运动正常为1分，有垂足现象，运动行为轻度异常为2分，术侧后爪瘫痪，运动行为严重异常为3分；2）MWT水平检测：将大鼠置于透明、安静的有机玻璃中，温度为23～25℃，适应30 min后通过Von Frey纤维丝对术侧后肢足底外侧进行刺激，共刺激3次，后对纤维丝刻大小进行记录，即为MWT；3）TWL水平检测：通过YLS-6B智能热板仪对TWL水平进行检测。

1.3.3 炎性因子、疼痛介质水平检测 取保存待检大鼠坐骨神经，充分碾碎，离心15 min（3 cm离心半径，3 000 r·min-1转速）对上清液进行提取，保存于-70℃冰箱中，各组大鼠中白细胞介素（interleukin, IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）、IL-10、β-内啡肽（β-end orphin, β-EP）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）水平通过酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法进行检测。

1.3.4 Toll样受体4（Toll like Receptor 4, TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）mRNA表达量检测 取保存待检大鼠坐骨神经，TLR4、NFκB mRNA表达量通过实时荧光定量法进行鉴定，提取总RNA，坐骨神经中RNA逆转录为cDNA采用Takara逆转录试剂盒，Primer 5.0软件设计引物序列后将PCR仪启动。通过2-△△Ct方法计算出TLR4、NF-κB的mRNA表达量。

1.3.5 TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白相对表达量检测 坐骨神经中的TLR4/NF-κB信号通路中的TLR4、NF-κB蛋白相对表达量通过Western Blot进行检测，将加入适量（1:10）组织蛋白抽离液加入大鼠坐骨神经，充分碾碎，离心15 min（3 cm离心半径，3 000 r·min-1转速）提取上清液，做BCA蛋白定性检测，将样品上样至8%SDS-PAGE凝胶上，经电泳后转移至PVDF膜上，TBST稀释的羊抗鼠TLR4、NF-κB（1:2 500）一抗在PBS封闭2 h后加入，后孵育过夜（4 ℃），洗膜3次，加入稀释羊抗鼠二抗（1:10 000），温室孵育1 h，做TBST洗膜3次，蛋白表达情况定量分析以GAPDH为内参照，重复试验3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析处理。计量资料采用均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用方差齐性检验，2组间比较采用重复测量的方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组光镜下病理切片对照

假手术组神经纤维轴索清晰、排列整齐，模型组神经纤维间质疏松、水肿，排列紊乱，普瑞巴林组、旋覆花汤低剂量组、旋覆花汤中剂量组旋神经纤维排序改善，间质水肿依旧存在，旋覆花汤高剂量组神经纤维排序基本恢复，水肿明显减轻。见图1。

图1 各组光镜下病理切片对照（HE染色，×400倍）

2.2 各组行为学比较

见表1。

表1 各组行为学比较（±s ，n= 20）

表1 各组行为学比较（±s ，n= 20）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与普瑞巴林组比较，▲P＜0.05；与旋覆花汤低剂量组比较，□P＜0.05；与旋覆花汤中剂量组比较，■P＜0.05

组别自发性疼痛评分/分MWT/sTWL/s假手术组0.00±0.0036.79±4.0213.56±2.02模型组2.21±0.21#21.14±2.89# 6.01±0.72#普瑞巴林组1.72±0.20#△26.21±2.51#△ 9.14±1.03#△旋覆花汤低剂量组1.71±0.21#△26.30±2.52#△ 9.12±1.05#△旋覆花汤中剂量组1.69±0.23#△25.98±2.60#△ 9.20±1.01#△旋覆花汤高剂量组1.30±0.14#△▲□■32.11±3.52#△▲□■11.37±1.59#△▲□■

2.3 各组炎性因子水平比较

见表2。

表2 各组炎性因子水平比较（±s ，n = 20） pg·mL-1

表2 各组炎性因子水平比较（±s ，n = 20） pg·mL-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与普瑞巴林组比较，▲P＜0.05；与旋覆花汤低剂量组比较，□P＜0.05；与旋覆花汤中剂量组比较，■P＜0.05

组别IL-1βTNF-αIL-10假手术组11.36±1.5842.73±5.2620.03±3.56模型组26.37±3.01#80.69±10.34#10.25±1.51#普瑞巴林组20.52±2.56#△60.51±6.14#△14.07±2.01#△旋覆花汤低剂量组20.60±2.58#△59.63±6.20#△13.98±2.10#△旋覆花汤中剂量组20.61±2.61#△60.62±6.38#△14.12±2.03#△旋覆花汤高剂量组15.72±1.69#△▲□■50.27±5.69#△▲□■16.58±3.14#△▲□■

2.4 各组疼痛介质水平比较

见表3。

表3 各组疼痛介质水平比较（±s ，n = 20） ng·L-1

表3 各组疼痛介质水平比较（±s ，n = 20） ng·L-1

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与普瑞巴林组比较，▲P＜0.05；与旋覆花汤低剂量组比较，□P＜0.05；与旋覆花汤中剂量组比较，■P＜0.05

组别β-EP5-HTPGE2假手术组180.59±20.03102.60±13.65161.59±20.73模型组101.37±12.54#191.37±24.73#254.96±31.80#普瑞巴林组131.72±16.25#△150.43±16.01#△210.72±23.60#△旋覆花汤低剂量组132.80±16.24#△151.37±15.98#△211.80±23.41#△旋覆花汤中剂量组130.68±17.01#△149.37±16.11#△209.73±24.01#△旋覆花汤高剂量组154.83±18.37#△▲□■120.83±15.74#△▲□■180.44±21.03#△▲□■

2.5 各组TLR4、NF-κB mRNA表达量比较

见表4。

表4 各组TLR4、NF-κB mRNA表达量比较（±s ，n= 20）

表4 各组TLR4、NF-κB mRNA表达量比较（±s ，n= 20）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与普瑞巴林组比较，▲P＜0.05；与旋覆花汤低剂量组比较，□P＜0.05；与旋覆花汤中剂量组比较，■P＜0.05

组别TLR4NF-κB假手术组1.00±0.011.00±0.01模型组2.56±0.33#2.63±0.37#普瑞巴林组2.01±0.21#△1.98±0.24#△旋覆花汤低剂量组1.99±0.23#△2.00±0.25#△旋覆花汤中剂量组2.03±0.20#△1.99±0.23#△旋覆花汤高剂量组1.42±0.15#△▲□■1.50±0.17#△▲□■

2.6 各组TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白相对表达量比较

见表5。

表5 各组TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白相对表达量比较（±s，n= 20）

表5 各组TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白相对表达量比较（±s，n= 20）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与普瑞巴林组比较，▲P＜0.05；与旋覆花汤低剂量组比较，□P＜0.05；与旋覆花汤中剂量组比较，■P＜0.05

组别TLR4NF-κB假手术组1.00±0.011.00±0.01模型组2.23±0.24#2.30±0.36#普瑞巴林组1.80±0.19#△1.89±0.21#△旋覆花汤低剂量组1.82±0.20#△1.90±0.22#△旋覆花汤中剂量组1.79±0.21#△1.91±0.23#△旋覆花汤高剂量组1.32±0.14#△▲□■1.35±0.17#△▲□■

3 讨论

中医认为神经病理性疼痛属“筋伤”“痹症”范畴，其核心病机为经络淤阻、气血不畅[6]。旋覆花汤属于辛润宣通法，具有散气节、利气下行、通血脉等作用，其中旋覆花可疏肝通络、化痰平喘、利尿消肿，归尾具有调经止痛、补血活血的作用，茜草可祛淤通经、凉血活血，桃仁具有抗炎镇痛、活血化瘀的作用，柏子仁可安心养神，以上诸药合用可发挥清热涤痰、活血化瘀之效[7]。本研究发现，神经病理性疼痛大鼠通过辛润宣通法干预后炎症反应减轻，疼痛介质水平改善，疼痛症状缓解，表明辛润宣通法可有效减轻神经病理性疼痛大鼠疼痛情况，且呈剂量依赖。

神经病理性疼痛临床症状以机械疼痛超敏、热痛觉过敏、稳定及明显自发性疼痛为主，中枢及外周机制均为神经病理性疼痛的发病机制，其中外周机制包括炎症因子活化、异位放电，中枢机制包括中枢敏化、中枢去抑制等，而炎性因子释放增多为神经病理性疼痛发病的主要原因[8]。神经病理性疼痛发生、发展期间胶质细胞被激活，进而转化为“活化”状态，使得神经损伤进一步加重，而活化的胶质细胞可释放IL-1β、TNF-α等炎症因子，其中IL-1β可由活化巨噬细胞以原蛋白形式表达，为疼痛信号传导的主要因子，可造成初级感觉神经元神经纤维敏感，进而导致疼痛超敏；TNF-α可结合星形胶质细胞中肿瘤坏死因子受体1，对氨基末端激酶活化起到了促进作用，使得星形胶质细胞进一步激活，神经病理性疼痛加剧[9]。IL-10则是对TNF-α表达具有抑制作用的抗炎细胞因子，在疼痛发生、疼痛治疗中发挥着重要作用，可发挥镇痛作用[10]。研究[11]发现，疼痛介质分泌情况与神经病理性疼痛病情存在密切联系，机体组织损伤后炎性因子大量释放，使得疼痛刺激加剧，进而促进了疼痛介质释放，β-EP是疼痛抑制性递质，其表达水平与痛觉敏感性呈负相关；5-HT、PGE2均为疼痛因子，可降低疼痛阈值。本研究发现，神经病理性疼痛大鼠通过辛润宣通法干预后自发性疼痛评分、IL-1β、TNF-α水平下降，MWT、TWL、IL-10水平上升，表明辛润宣通法可减轻神经病理性疼痛大鼠炎症反应，改善机械疼痛超敏、热痛觉过敏、稳定及明显自发性疼痛。

TLR4/NF-κB是与神经根性疼痛、膝骨关节炎、骨癌痛、盆腔炎等多种炎性、疼痛性疾病相关的信号通路[12-13]。TLR4是由小胶质细胞表达的Toll样受体家族成员，在先天免疫激活、病原体识别中发挥着重要作用，为先天免疫激活的关键调节剂，激活后的TLR4可释放多种增强神经元兴奋性的调节剂及神经递质，进而参与了炎症反应调节、神经病理性疼痛加重及维持，而NF-κB可由TLR4激活，激活后的NF-κB可促进炎性细胞因子合成、分泌，且可启动获得性免疫应答，最终推动了神经病理性疼痛疾病进展[14]。旋覆花汤中的桃仁可抑制炎性反应，进而对TLR4/NF-κB信号通路起到了抑制作用，而茜草对血液循环具有促进作用，进而阻断了疼痛神经传导，抑制了致痛因子表达，促进了镇痛物质释放，本研究发现，神经病理性疼痛大鼠通过辛润宣通法干预后TLR4、NF-κB表达量下降，提示辛润宣通法可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路而抑制炎性反应，减轻疼痛。