铁过量致雏鸡脾氧化应激及病理组织学观察

安裕智,孙 宁,孙凤娇,吕相龙,吕晓萍,刘超男,高雪丽

(东北农业大学动物医学学院 黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

铁(Fe)是动物机体进行生理活动必需的元素,在生物代谢过程中发挥重要作用[1]。铁常以亚铁(Fe2+)、铁(Fe3+)的形式存在,具有很强的氧化还原性质[2]。过量铁具有极强的毒性,机体铁超载会引起血色素沉着症[3]、肝损伤和癌症等[4-5]。鸡饲养标准(NY/T 33-2004)规定:雏鸡饲料中铁最大耐受量为500 mg/kg。过量铁可导致肉鸡体重、生长性能、腹脂率和肉质水平严重降低[6],但是过量铁对雏鸡免疫器官的影响研究较少。脾脏作为体内最大的外周免疫器官,容易受到重金属毒性影响[7],是铁超载时主要靶器官之一。氧化应激是指氧化剂的产生和抗氧化剂的防御之间的不平衡,可导致生物系统的损害[8]。试验证明,许多重金属可使动物组织中MDA、NO含量升高,GPx、CAT等抗氧化物质减少或功能减弱,导致自由基聚集并引发疾病[9-10]。本研究通过对雏鸡脾脏氧化与抗氧化功能的检测,并结合病理组织学变化,探讨过量铁对雏鸡脾脏的氧化应激损伤机制,为铁的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 75只1日龄健康白羽肉鸡,哈尔滨先锋孵化场提供,自由饮食饮水,适应性饲喂14 d。

1.1.2 主要试剂 丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及铁含量检测试剂盒,南京建成生物工程研究所产品;普鲁士蓝染色试剂盒,索莱宝科技有限公司产品;苏木素染液、伊红染液,东北农业大学病理生理实验室提供;硫酸亚铁(FeSO4·H2O),纯度≥91.4%,四川龙蟒集团产品。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(ELx808),美国Bio-Tek仪器有限公司产品;小型台式冰冻离心机(Eppendorf 5430/R),艾本德中国有限公司产品;SCIENTZ-48L冰冻型高通量组织研磨器,宁波新芝生物科技股份有限公司产品;轮转切片机(HM340E),MICROM国际股份有限公司产品;NIKON ECLIPSE 80i共聚焦荧光显微镜和NIS-Elements病理成像系统,尼康仪器(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验动物处理 将75只15日龄健康白羽肉鸡随机分为3组:对照组(Control)、铁过量1组(E1)和铁过量2组(E2);将硫酸亚铁水合物(FeSO4·H2O)溶于水并和饲料充分搅拌,分别在饲料中添加50、500和1000 mg/kg,连续饲喂3 d。于铁过量后1、3、7、14、21 d各组随机抽取5只雏鸡,称重,心脏采血致死,取脾脏,观察大体形态并称重。取部分脾脏置于100 mL/L中性福尔马林固定,4℃保存,剩余脾脏分装于-80℃保存。

1.2.2 检测指标及方法

1.2.2.1 铁含量检测 将40 mg脾脏放入装有400 mL生理盐水的EP管中,振荡匀浆,取上清,按检测试剂盒说明操作,测量520 nm吸光度值(OD值),并根据以下公式计算:

组织铁含量(μmol/g)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度÷待测蛋白浓度(g/L)。

1.2.2.2 MDA及H2O2含量测定 将15 mg脾脏放入含有135 mL生理盐水的EP管中,振荡匀浆,取上清,按照试剂盒说明书检测,分别在波长532 nm和405 nm测量MDA及H2O2吸光度值(OD值),并根据以下公式计算:

MDA含量(nmol/mg)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度÷待测蛋白浓度(nmol/mg)。

H2O2含量(nmol/g)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度÷待测蛋白浓度(nmol/g)。

1.2.2.3 CAT、GPx活力和T-AOC水平测定 将30 mg脾脏放入含有270 mL生理盐水的EP管中,振荡匀浆,取上清,按照试剂盒说明书检测,分别在波长405 nm和520 nm下测量CAT、GPx吸光度和T-AOC吸光度值(OD值),并根据以下公式计算:

CAT活力(U/mL)=(对照OD值-测定OD值)×271/(60×取样量)/待测样品蛋白浓度(mg/mL)。

GPx活力(U/mg)=(非酶管OD值-酶管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度÷待测蛋白浓度。

T-AOC(U/mg)=(测定OD值-对照OD值)/0.3×(反应液总量/取样量)×匀浆蛋白液浓度(mg/mL)。

1.2.2.4 脾脏器官指数 记录雏鸡和脾脏重量,观察大体形态,根据公式计算脾脏器官指数:脾脏指数=脾脏重量(g)/体重(kg)。

1.2.2.5 病理组织学观察 脾脏经10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、HE染色和普鲁士蓝染色。

1.2.2.6 数据处理 试验数据用GraphPad Prism 9.5软件进行双因素方差分析,并制作图表,所有数值以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 雏鸡铁过量后脾脏铁含量变化

铁过量后1～14 d,雏鸡脾脏铁含量极显著高于对照组雏鸡(P<0.01);1～7 d后铁过量2组雏鸡脾脏铁含量显著或极显著高于铁过量1组(P<0.01或P<0.05)(图1)。

*P<0.05,**P<0.01)

2.2 雏鸡铁过量后脾脏MDA及H2O2含量变化

铁过量后1～21 d,除铁过量1组14 d MDA含量无显著变化外,雏鸡脾脏MDA及H2O2含量均显著或极显著高于对照组(P<0.01或P<0.05);铁过量2组MDA及H2O2含量于铁过量后1～14 d极显著高于铁过量1组(P<0.01)(图2、图3)。

**P<0.01)

*P<0.05,**P<0.01)

2.3 雏鸡铁过量后脾脏CAT、GPx和T-AOC变化

铁过量后1～21 d,雏鸡脾脏CAT、GPx活力和T-AOC水平均显著或极显著低于对照组(P<0.01或P<0.05 );铁过量2组显著或极显著低于铁过量1组(P<0.01或P<0.05)(图4～图6)。

*P<0.05,**P<0.01)

*P<0.05,**P<0.01)

*P<0.05,**P<0.01)

2.4 雏鸡铁过量后脾脏器官指数及眼观病理变化

雏鸡铁过量2组脾脏指数1～3 d显著或极显著高于对照组(P<0.01或P<0.05),仅在1 d显著高于铁过量1组(P<0.05)(图7)。雏鸡铁过量后1～7 d,脾脏颜色暗红、不同程度肿大或充血,1周后恢复正常(图 8)。

*P<0.05,**P<0.01)

图8 雏鸡铁过量后脾脏眼观病理变化

2.5 雏鸡铁过量后脾脏病理组织学观察

HE染色显示,铁过量2组脾脏组织细胞排列混乱,网状内皮细胞增生。红髓内有散落的红细胞及嗜中性粒细胞,部分脾细胞及淋巴细胞皱缩。白髓和红髓结构模糊,白髓占比减少,红髓占比增大。白髓脾小体变大且结构模糊,淋巴细胞减少,动脉周围淋巴鞘显著增厚(图9C)。铁过量1组脾脏动脉周围淋巴鞘显著增厚,红髓内有红细胞及嗜中性粒细胞(图9B)。普鲁士蓝染色显示:两组雏鸡脾脏红髓和白髓均有铁血黄素,并且铁过量2组蓝染含铁血黄素颗粒较1组增多(图9E、9F)。

A、D.对照组;B、E.铁过量1组;C、F.铁过量2组。A～C.HE 400×;“→”,脾小体;D～F.Perls 200×;“↑”,含铁血黄素沉积

3 讨论

铁过量后,雏鸡脾铁含量显著升高,脾急性肿胀。铁过量后雏鸡脾脏组织结构损伤,细胞排列混乱。红髓内出现散落的红细胞及嗜中性粒细胞,动脉周围淋巴鞘显著增厚,说明脾脏遭遇抗原刺激引起免疫应答。雏鸡摄入过量铁后,白髓占比减少,脾小体数量增多,且结构模糊,淋巴细胞数量减少,机体免疫功能下降。普鲁士蓝染色显示铁过量后,雏鸡脾脏红髓分布有蓝染含铁血黄素,且随铁剂量的增加含铁血黄素分布越广泛。以上结果证明脾脏吸收铁的能力有限,雏鸡摄入过量铁后,铁会在脾脏中沉积并造成组织结构损伤,进而影响脾脏免疫功能。

综上所述,摄入过量铁后,雏鸡脾脏MDA、H2O2含量升高,CAT、GPx活力、T-AOC水平降低,表明过量铁可致雏鸡脾脏氧化水平升高,抗氧化能力下降,机体处于氧化应激状态。脾脏作为体内最大的外周免疫器官,是铁超载时的靶器官之一,铁过量后,脾小体数量增多且结构模糊,组织结构损伤,过量铁通过氧化应激导致脾脏组织损伤,从而影响脾脏免疫功能。