林麝源蜡样芽孢杆菌分离鉴定及致病性试验

吕 妮,李 颖,李 蔚,胡清霞,陈雪梅,张琰杰,马永华,王玉龙,王兴龙*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;2.铜川市王益区疫病预防控制中心,陕西铜川 727000;3.汉中职业技术学院,陕西汉中 723000)

林麝(Moschusberezovskii)又名香獐,其雄麝香腺囊分泌的麝香是中医药的名贵药材,亦是一种高级香料,具有极高的药用价值和经济价值[1]。林麝主要栖息于针阔混交林中,也适于在针叶林的环境生活,栖息高度可达2 000～3 800 m,但低海拔环境也能生存,在我国主要分布于北抵宁夏六盘山、陕西秦岭山脉,东至安徽大别山、湖南西部,西至四川、西藏波密、察隅、云南北部,南至贵州、广东及广西北部山区[2]。为有效保护林麝,国家近年来支持鼓励人工养殖林麝,但由于各养殖单位缺乏技术与种源交流,缺少龙头企业和相关科研机构示范引导和技术研究等,人工养殖林麝死亡率居高不下[3]。林麝的易发疾病有10类53种[4],呼吸道类疾病最多。本文收集死亡时间不超过24 h的林麝进行剖检,采集死亡林麝的淋巴结、肺脏、肝脏等病变组织,通过细菌分离鉴定、生化试验和药物敏感性试验对分离菌进行了特征分析,并为该病的有效防治提供理论依据。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和样品来源 昆明小鼠15只,体重30～40 g,20日龄左右,购自西安交通大学医学院。陕西省某林麝养殖基地死亡24 h内的1只3岁左右的林麝,无菌采取其淋巴结、肺脏、肝脏等病变组织,低温保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 普通营养培养基、LB营养培养基、绵羊血琼脂培养基、DNA Marker DL 2 000 Plus、2×Taq MasterMix均为南京诺唯赞生物科技有限公司产品;细菌微量生化鉴定管,杭州滨和微生物试剂有限公司产品;细菌DNA提取试剂盒(离心柱型),天根生化科技有限公司产品;恒温摇床(THZ-300)和恒温培养箱(DRP-9162),上海森信有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 观察临床症状及剖检 观察记录该基地发病林麝的临床症状,对发病死亡的林麝进行解剖,检查内脏病变,采集病料并进行记录。

1.2.2 细菌分离鉴定 无菌采取淋巴结、肺脏及肝脏病变组织的切面,分别涂布于普通琼脂培养基和5%绵羊血琼脂培养基上,37℃恒温培养24～36 h,观察有无细菌生长。若有细菌生长,则用无菌接种环挑取形态一致的菌,采用三段划线法分别接种于普通营养琼脂培养基和5%绵羊血琼脂培养基,置于37℃恒温箱中纯化培养12～16 h。优势菌进行细菌纯化后,对细菌进行菌落形态的观察和革兰氏染色镜检。

1.2.3 生化试验 将分离纯化菌接种在葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甲基红、过氧化氢酶、乙酰甲基甲醇、尿素、甘露醇、木糖、吲哚、乳糖和硫化氢等12种微量生化鉴定管,37℃恒温箱培养24～48 h,记录结果并参考《伯杰细菌鉴定手册》第8版进行判断。

1.2.4 16S rRNA基因测序及遗传进化分析 以分离菌株的DNA为模板,16S rRNA PCR通用引物LPW-57(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和LPW-58(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)为上下引物,20 μL反应体系进行PCR扩增,PCR扩增程序:94℃ 2 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35个循环;72℃ 5 min。用PCR产物进行核酸凝胶电泳,比对目的条带大小后将PCR产物送到西安擎科生物有限公司进行测序。将测序结果与NCBI数据库中已有的序列进行Blast比对,并选取数据库中部分菌株序列与分离菌株基因序列进行系统遗传进化分析,用MEGA7.0软件构建进化树。

1.2.5 药敏试验 分离菌的药敏试验用纸片法进行。用生理盐水将菌液矫正至0.5麦氏比浊管浓度,均匀涂布于普通营养琼脂平板上,用无菌镊子贴上药敏片,置37℃恒温箱培养18 h后,测量抑菌圈的直径,抑菌环直径判定依据欧盟药物敏感性试验标准(EUCAST)。

1.2.6 小鼠致病性试验 挑取纯培养的单菌落溶于无菌PBS中制成菌悬液。将20日龄健康小鼠随机分成3组,每组5只:阴性对照组、1×108CFU/mL剂量组和1×109CFU/mL剂量组。对照组小鼠腹腔注射生理盐水,0.25 mL/只;试验组小鼠分别腹腔注射108和109CFU/mL的菌液,0.25 mL/只;观察小鼠发病情况。

2 结果

2.1 临床症状及病理变化

林麝发病初期体温升高,部分体温可达41℃,随后出现精神沉郁、食欲废绝、呼吸急促等症状;个别林麝出现跛行、头颈扭曲等神经症状。剖检可见死亡林麝淋巴结、咽部以及胆囊肿大;肝脏边缘钝厚有出血点,且与胸腔产生粘连;肺脏肿大,广泛性出血(图1)。

图1 样品临床症状及肺脏病变

2.2 细菌分离鉴定

将分离的优势菌在37℃恒温箱培养12～16 h后,该菌在普通营养琼脂上形成白色、圆形、凸起、直径约1～3 mm、呈白蜡状的菌落;在血琼脂平板上形成浅灰色、圆形、凸起、似毛玻璃状的菌落。革兰氏染色镜检,该菌为革兰氏阳性杆菌,呈单个或长链状排列(图2)。

A.普通营养琼脂平板生长形态;B.血平板生长形态;C.革兰染色镜检(1 000×)

2.3 生化试验

生化鉴定结果显示,该菌可分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甲基红、过氧化氢酶、乙酰甲基甲醇等,但是不分解尿素、甘露醇、木糖、吲哚、乳糖、硫化氢等(表1)。与《伯杰细菌鉴定手册》第8版比对,该分离菌株为疑似蜡样芽孢杆菌。

表1 生化鉴定结果

2.4 16S rRNA基因测序结果及系统进化树

对分离菌株进行16S rRNA PCR扩增,PCR扩增产物大小约为1 300 bp(图3),与预期片段大小一致。将测序结果与NCBI数据库中已有的序列进行Blast比对分析,该菌与模式菌株Bacilluscereus同源性为99%,结合菌株的生化特性和形态,鉴定该菌为蜡样芽孢杆菌,命名为LN-20221212。通过Mega 7.0软件对该菌株构建系统发育进化树(图4),该菌株和与其他分离菌株的同源性较远。

M.DNA标准DL 2 000; 1.分离菌株; 2.鸭源蜡样芽孢杆菌; 3.牛源蜡样芽孢杆菌; 4.阴性对照

图4 基于16S rRNA构建的系统发育树

2.5 药敏试验

蜡样芽孢杆菌对哌拉西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢他啶、丁胺卡那、庆大霉素和环丙沙星敏感,对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、多黏菌素B和复方新诺明耐药(表2)。

表2 分离菌的药物敏感性试验结果

2.6 小鼠致病性试验

注射109CFU/mL的试验小鼠4 h后出现精神沉郁、食欲不振的症状,12 h后试验组小鼠开始出现昏迷死亡现象,24 h内攻毒小鼠全部死亡;注射108CFU/mL的试验小鼠6 h后出现精神沉郁和食欲不振的症状,12 h后部分小鼠出现昏迷死亡现象,48 h后攻毒小鼠全部死亡。解剖死亡小鼠发现肺脏肿大并出血;肝脏质地变脆、颜色变灰,对照组小鼠无明显异常。试验组死亡小鼠肺脏、肝脏进行细菌分离培养,革兰氏染色后镜检,得到典型的革兰氏阳性芽孢杆菌,而对照组小鼠肺脏、肝脏细菌分离培养,染色检查未见该菌,表明了蜡样芽孢杆菌对小鼠具有较强的致病性。

3 讨论

蜡样芽孢杆菌可引起人食物中毒和严重的非肠道感染[5]。该菌两端平整,呈短链排列,无荚膜,有的菌株具有周鞭毛,属于兼性厌氧菌,最适生长温度为30～32℃,可生长pH为4.9～9.3,营养要求比较低。蜡样芽孢杆菌的致病性与组织破坏性/反应性胞外酶的产生密切相关[6]。在这些分泌性毒素中,有四种溶血素[7],3种不同的磷脂酶,1种呕吐诱导毒素,以及3种成孔肠毒素,即溶血素BL(HBL)、非溶血性肠毒素(NHE)和细胞毒素K[8]。近年来,蜡样芽孢杆菌感染动物的情况逐渐增多[9],许多地方报道了与蜡样芽孢杆菌密切相关的仔猪腹泻、奶牛子宫内膜炎、马皮肤脓肿结节、哺乳仔猪死亡、牛猝死等病例,分离的蜡样芽孢杆菌对小鼠有不同程度的致死性[10]。

本文所用蜡样芽孢杆菌来源于陕西省某林麝养殖场猝死林麝的淋巴结、肝脏和肺脏等病理组织。该菌对青霉素、苯唑西林、氨苄西林等兽医临床常用抗生素表现出较高的耐药性,而庆大霉素、四环素与氟苯尼考等对该菌抑制作用明显。分离菌株对健康小鼠有明显的致病性,试验组小鼠在接种菌液后出现精神沉郁、食欲减退、颤抖甚至死亡。无菌分离采集死亡小鼠的病变组织,涂片染色后镜检,得到典型的革兰氏阳性芽孢杆菌。试验结果表明该菌具有致病性,为林麝相关疾病的治疗和防控提供了参考。