纸基法血液基因组DNA的提取与应用

刘 壮,何茹月,胡圣伟

(石河子大学生命科学学院,新疆石河子 832003)

DNA分子扩增与基因测序已成为遗传学和分子诊断领域的重要手段[1]。分子诊断应用于转基因检测和分子标记检测[2],比酶或抗体检测灵敏度高、灵活性强,通过PCR扩增用微量DNA即可达到试验目的,而样品基因组DNA的获取和纯化则决定检测结果的完整度和准确性。目前,基因组样本DNA提取方法主要包括苯酚-氯仿抽提法[3]、试剂盒法[4]、煮沸法[5]、磁珠法[6]等。以大鼠和小鼠的鼠尾及脚趾为试验材料[7],用苯酚-氯仿抽提法萃取得到鼠尾组织的基因组DNA,但此方法耗时较长且有毒性,长时间威胁人体健康。用试剂盒提取法从所有毛绒干样本中获得了高质量的DNA[8],但此法成本偏高[9]。煮沸法可以避免耗时和成本高的缺点,但在一定程度上影响DNA纯度、浓度和完整度。磁珠法利用磁珠粒子表面化学物质的差异性捕获和纯化核酸,可大批量进行样本检测,但依赖大型仪器设备,受试验区域的影响[10]。因此,基于已有的核酸提取方法,开发一种简易快速基因组DNA提取方法很重要。

Whatman No.1纤维素滤纸价格低廉、便携且易于修饰,可以在碱性溶液中几秒内吸附带负电荷的DNA,经过简单的洗涤就可直接释放到扩增反应液中[11]。用Whatman No.1滤纸片在30 s内可从拟南芥叶片和猪肺中提取并纯化出DNA[12]。用常规定性滤纸作为核酸吸附的载体提取出中药DNA[13],而对于下游的核酸扩增验证则与传统核酸提取法一致。随着基因工程技术的不断发展和完善,基因编辑在生物学研究中越来越重要[14]。目前对于基因编辑小鼠后代的基因型快速检测的方法仍存在耗时长、高成本等限制[15]。因此,基于基因编辑型小鼠稳定遗传理论和WhatmanNo.1纤维素滤纸的吸附特性,寻求一种对子代小鼠高效、稳定、低创伤的DNA提取方法,为大量基因编辑小鼠后代基因分型提供可行方案。

本文用Whatman No.1纤维素滤纸制备出特定结构的试纸条,以基因野生型和编辑型C57BL/6J小鼠为试验材料建立纸基法。对比试剂盒提取法和煮沸法,用PCR扩增和测序分析以验证基因分型结果的准确性。此研究为快速检测和基因分型提供了重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6只5～6周龄GDF11基因敲除杂合型(GDF 11+/-;2雄4雌)和9只雄性野生型(GDF 11+/+)C57BL/6J小鼠。饲养条件满足光照/黑暗12 h交替,自由摄食饮水。所有小鼠由石河子大学动物基因工程实验室饲养与繁殖,试验均在石河子大学动物护理委员会批准的方案下进行。

1.1.2 主要试剂与仪器 Tris-HCL、氯化钠(NaCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS),北京索莱宝科技有限公司产品;天根血液基因组提取试剂盒(TIANmp Blood DNA Kit)、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、2X SanTaqFast PCR Mix、蛋白酶K,上海生工生物工程股份有限公司产品。DNA Marker 2 000,上海天根生化科技有限公司和北京索莱宝科技有限公司产品;Whatman No.1滤纸,上海金畔生物科技公司产品。Mastercycler pro梯度PCR仪、高速离心机,Eppendorf公司产品;琼脂糖凝胶核酸电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;凝胶成像仪,Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 纸基法的构建 基于文献[12],改进Whatman No.1纤维素滤纸结构。将Whatman No.1纤维素滤纸裁剪成55 mm×2 mm的长方形纸条,用镊子夹取纸条一侧,将纸条的52 mm浸入液体石蜡中(手柄区),未浸蜡区域形成一个6 mm×2 mm的长方形(结合区),制备标准试纸条(图1)。

图1 纸基法流程图

通过断尾采血法收集3只野生型小鼠a、b、c的血液各50 μL,加入200 μL A液(10 mmol/L Tris pH 8.0;15 mmol/L NaCl;10 mmol/L EDTA pH8.0;0.4% SDS;200 μg/mL蛋白酶K)中,放入2颗直径5 mm的无菌钢珠,充分剧烈摇晃30 s形成血液裂解液。将试纸条DNA结合区反复浸入血液裂解液3次后放入B液(10 mmol/L Tris pH 8.0;0.1% Tween 20)中洗涤5次,随后将吸附有小鼠核酸DNA的试纸条放入PCR反应体系混合液中,静置3 s,随后进行PCR扩增反应。用天根血液基因组提取试剂盒,按说明书从上述3只野生型小鼠全血中提取总 DNA,作为纸基法的对照。根据C57BL/6J小鼠特有的GDF11(GenBank登录号:NC-000076.7)和MSTN(GenBank登录号:NC-000067.7)核苷酸序列设计得到3种引物Gdf11-PMT、Gdf11-KI和MSTN(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2测试3只野生型小鼠的基因型,以验证该引物的特异性;用以上3种引物,验证纸基法的稳定性和特异性。。

表1 引物序列信息

1.2.2 基因敲除小鼠的繁殖 用F0代1雄(GDF 11+/-)和2雌(GDF 11+/-)的配种模式,对C57BL/6J小鼠进行配种,自然受孕21日后,将F1代小鼠饲养至断奶4周后,随机抽取10只F1代小鼠编号为1～10号作为小鼠基因型鉴定的材料来源。

1.2.3 3种DNA提取方法的比较应用 试剂盒提取法:将随机选取的基因敲除型小鼠后代中的10只小鼠,剪取0.2～0.5 cm尾尖组织,剪碎后放于2 mL离心管内。用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒说明书提取得到小鼠基因组DNA。

煮沸法:取上述10只小鼠的0.2～0.5 cm尾尖组织,加入200 μL DNA抽提缓冲液(50 mmol/L Tris·HCl pH8.0;10 mmol/L EDTA;0.1% SDS;100 mmol/L NaCl)和10 μL 20 mg/mL 蛋白酶K,混合均匀后在55℃恒温水浴锅中消化20 min,100℃煮沸10 min,静置20 min得到含有小鼠基因组DNA的裂解液。

纸基法:取上述10只小鼠的样本,根据1.2.1的方法得到PCR扩增反应的模板。

1.2.4 PCR扩增和电泳检测 根据NCBI上已公布的C57BL/6J小鼠序列信息和GDF11基因编辑型小鼠构建方案(图2)得到基因型鉴定标准,基因片段只有一条大小491 bp或404 bp片段,基因型为纯合子(GDF 11-/-)或野生型(GDF 11+/+);基因片段一条大小491 bp,另一条大小404 bp,基因型为(GDF 11+/-)。设计鉴定基因敲除型小鼠的引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2(表1)。

图2 基因编辑型小鼠构建方案图

PCR扩增体系:ddH2O 9 μL,5×PCR Mix 10 μL,DNA模板0.5 μL,上、下游引物(10 mmol/L)0.5 μL。PCR扩增条件为:95℃ 3 min;95℃ 20 s,60℃ 20 s,72℃ 40 s,循环35次;终延伸72℃ 2 min;4℃保温。PCR扩增反应结束后,使用1.5%琼脂糖凝胶电泳对5 μL反应体系进行电泳,利用凝胶成像仪分析电泳结果。

1.2.5 测序结果验证 用上述10个样本的琼脂糖电泳结果,根据每个样本扩增出的大小不同的DNA片段预测基因敲除型小鼠后代的基因型,随机选取2个样本的PCR扩增产物,由上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析,验证依据电泳条带大小判断基因敲除型小鼠后代基因型结果的准确性。

2 结果

2.1 试纸条检测方法的构建

用试剂盒法作为对照,用纸基法提取a、b、c野生型小鼠血液中的基因组DNA作为模板﹐用Gdf11-PMT、Gdf11-KI和MSTN 3种引物进行特异性PCR进行扩增(图3)。PCR结果显示,用引物Gdf11-PMT稳定克隆出315 bp符合预期的DNA片段(图3A);用引物Gdf11-KI稳定克隆出567 bp符合预期的DNA片段(图3B);用引物MSTN稳定克隆出671 bp符合预期的DNA片段(图3C)。基于纸基法,验证用于编辑型小鼠基因分型的特异性引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2的PCR扩增,结果显示a、b、c样本未被Gdf11-KO1引物特异性诱导扩增,由Gdf11-KO2引物扩增出404 bp左右的条带,说明纸基法为PCR扩增提供了基因组DNA模板(图3D)。

M.DNA标准DL 2 000;NC.阴性对照;1～3.用纸基法和引物Gdf11-PMT(A)、Gdf11-KI(B)、MSTN(C)、Gdf11-KO1(D)对3个样本的PCR扩增结果;4～6.用试剂盒提取法和引物Gdf11-PMT(A)、Gdf11-KI(B)、MSTN(C)、Gdf11-KO1(D)对3个样本的PCR扩增结果

2.2 3种DNA提取方法的比较应用

通过试剂盒提取法得到1～10号10只基因敲除型小鼠后代基因组DNA,用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分别对小鼠的基因组DNA进行PCR扩增鉴定基因型(图4A),根据克隆片段的有无和大小表明1、4、6、9号为野生型小鼠,2、3、5、7、8号为基因敲除杂合型小鼠,而10号小鼠为基因敲除纯合型小鼠。通过煮沸法得到1～10号10只基因敲除型小鼠后代基因组DNA,利用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分别对小鼠的基因组DNA进行PCR扩增进行基因型鉴定(图4B),根据PCR结果说明1、4、6、9号小鼠为野生型小鼠,3、7、8号为基因敲除杂合子小鼠。

A.试剂盒提取法;B.煮沸法;C.纸基法。M.DNA标准DL 2 000;NC.阴性对照;1～10.用引物Gdf11-KO1分别对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10号小鼠的基因组DNA PCR扩增结果,11～20:用引物Gdf11-KO2分别对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10号小鼠的基因组DNA PCR扩增结果

通过纸基法得到1～10号10只基因敲除型小鼠后代基因组DNA,利用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分别对小鼠的基因组DNA进行PCR扩增进行基因型鉴定(图4C),根据PCR结果说明1、4、6、9号为野生型小鼠,2、3、5、7、8号小鼠为基因敲除杂合子小鼠,而10号小鼠为基因敲除纯合子小鼠。与试剂盒提取法鉴定结果一致,与利用煮沸法鉴定结果存在差异。

2.3 测序验证结果

根据以上3种DNA提取方法的比较应用,随机选取10号小鼠和6号小鼠基因组DNA的PCR扩增产物测序分析,结果显示10号小鼠为基因敲除纯合子小鼠(GDF 11-/-)(图5A),6号小鼠为野生型小鼠(GDF 11+/+)(图5B),试剂盒提取法与纸基法对于基因分型的检测结果与测序结果一致。

图5 测序峰图结果展示

3 讨论

DNA提取是用现代生物技术解析分子检测和基因分型的关键。用酚/氯仿法提取DNA时[16],用PCR对绵羊血液布鲁氏菌的检测下限仅为1×106CFU/mL,其影响因素主要是无法有效去除血液中的血红蛋白等PCR抑制剂。有研究通过Whatman FTA卡片存储基因组DNA,用低盐溶液的洗脱后,稳定了PCR扩增反应[17]。

用纸基法进行HPV DNA的提取极大简化了临床宫颈脱落细胞样本中HPV DNA的提取步骤[18]。用全自动纸基微流控装置,通过碱裂解法以及Fusion 5纸片成功提取到血液DNA。本研究用Whatman No.1纤维素试纸条进行小鼠全血内基因组DNA的提取,用4种特异性引物,PCR扩增反应验证了该方法的稳定性和特异性。对于纸基法中DNA结合量和洗涤质量后期可以通过改变试纸中DNA结合区域的大小和洗涤液的体积来微调提取系统,从而达到核酸定量转移的目的。

根据基因编辑生物在实验室中广泛应用的现状,对于该生物后代基因分型检测也成为实验室常备的检测手段[19]。本文用3种DNA提取法对随机的10只基因编辑小鼠进行基因分型检测,纸基法与煮沸法和试剂盒提取法对基因组DNA提取具有更多优势。纸基法和试剂盒提取法鉴定结果基本完全一致,评判出4只野生型小鼠、5只基因敲除杂合型小鼠和1只基因敲除纯合型小鼠。试剂盒提取法保障了动物组织DNA提取的准确性,满足分子基因检测的需求,但其检测成本大以及试验条件都阻碍了该方法的大规模应用。煮沸法鉴定结果存在偏差的原因可能由于煮沸法获得的DNA不纯,存在污染物和抑制剂,提取的DNA质量较差,影响PCR扩增反应的进行,导致基因型判定出现误差。测序结果辅助验证了纸基法对PCR分型结果的准确性。总之,纸基法表明了该基因组DNA提取系统可以轻松地将基因组DNA从污染物和抑制剂中分离和洗脱出来,为大规模的对基因编辑小鼠后代进行基因型分类提供了技术基础。

本文用Whatman No.1纤维素滤纸制备得到的试纸条,进行基因组DNA的提取和PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳验证了该纸基法的稳定性和特异性。横向比较纸基法、试剂盒提取法和煮沸法3种DNA提取法,最后对随机选取的样本DNA进行测序分析,验证了纸基法对与基因敲除小鼠后代基因型测定的准确性。以上研究表明了一种简易快速基因组DNA提取方法的建立为分子鉴定和基因分型提供了一种更为快速、便捷、准确、有效的检测方法。