当归活性成分抗阿尔茨海默病网络药理作用机制探究*

曾庆涛，兰美华，李桂云，王雅乐，黄海，吴红彦

广东省深圳市罗湖区中医院 广东罗湖 518000

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以老年人为主体，慢性的中枢神经性退行性疾病，以认知障碍、记忆衰退为主要表现，伴随一系列脑功能障碍[1]。该病目前机制不明确，大多数学者认为与β淀粉样蛋白（βA）的沉积有关[2]。随着全球人口老龄化的逐年递增，预估2050年AD患者将增至约1.38亿[3]。目前，临床主要以乙酰胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体阻滞剂等药物治疗，但疗效欠佳、毒副作用颇多[4]。因此，迫切需要在AD药物开发方面取得突破性进展，以治疗潜在的疾病，并阻止伴随而来的最终导致症状恶化的细胞损伤。然而，目前进行了所有艰苦的研究工作，还没有有效的最佳治疗药物。

本品为伞形科植物当归的干燥根。主产于甘肃。秋季末采挖，除去须根及泥沙，待水分稍蒸发后，捆成小把，上棚，用烟火缓缓熏干。切薄片，生用或酒炙用，中药药理揭示，该药具有改善AD小鼠记忆缺失[5]、抗炎抗衰老[6-7]、调节机体神经递质[8]等作用，对AD具有防治作用。当归常与其他中药按组分配伍治疗AD，可见当归治疗AD具有一定潜力。然而，目前当归治疗AD的研究以临床及动物研究为主[9]，尚未揭示AD靶点与当归的相互作用机制，中药网络药理学通过筛选当归主要有效活性成分、作用靶点，构建“成分-靶点-疾病”[10]网络图，为揭示当归主要有效成分多成分-多靶点-多通路等特点，便于进一步探究当归的具体作用机制。

资料与方法

1 活性成分筛选

网络药理学系统[11]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacolo-gy Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），筛选当归有效成分，通常以药代动力学参数（Absorp-tion and Distribution and Metabolism and Excretion，ADME）为依据，设置口服生物利用度（Oral Bioavail-ability，OB）≥30，药物类似度（Druglikeness，DL）≥0.18设为筛选条件[12]，筛选主要有效活性成分。

2 疾病相关靶点基因获取

以“Alzheimer disease”为检索词，运用GeneCards[13]（ https： / /www.genecards.org /） 、OMIM[14]（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）数据库，检索AD的靶点，将2次检索的AD靶点重合，剔除重复的相关靶点。运用R软件，将药物和疾病靶点获取交集，获取治疗AD的靶点，并绘制韦恩图。

3 药物-靶点-疾病网络图的构建

将药物主要有效活性成分与AD靶点取交集，获得治疗AD的关键靶点。利用Cytoscape 3.7.1 软件，构建“药物-靶点-疾病”网络图。图中节点（Node）代表基因、蛋白或活性成分；边（Edge）代表活性成分与相互作用靶点之间的联系。运用网络图可深入探究当归治疗AD的作用机制。

4 构建PPI（Protein- ProteinInteraction）

将当归治疗AD的靶点，上传STRING[15]（https：//string-db.org）中，设置筛选物种为“Homo Sapiens”，得到蛋白的相互作用，以txt文件储存。运用Cytoscape 3.7.1[16]软件，设置好相关参数，对PPI图进行可视化处理，获得当归治疗AD靶点蛋白相互作用（PPI）网络图。

5 GO注释及KEGG通路分析

在R软件中安装生物包Bioconductor，用于分析GO注释信息。ClusterProfiler包为基因数据最常用包之一，安装于R软件中，可搜索GO 注释和KEGG（http：//rest.kegg.jp/link/hsa/pathway）进行通路分析，其可视化功能特点突出。以筛选条件P＜0.05进行筛选，进行通路分析，同时将分析的结果进行可视化处理。

结 果

1 活性成分筛选

运用TCMSP数据库，筛选当归活性成分为125个，设置OB≥30和DL≥0.18为筛选条件，筛选出主要有效活性成分2个，见表1。

表1 当归主要有效活性成分

2 当归治疗AD的作用靶点

通过TCMSP数据库，筛选出当归主要有效活性成分为2个。通过GeneCards、OMIM库搜索AD靶点合并，剔除重复靶点，获得735个靶点。运用R软件前，须安装“VennDiagram”程序包，获得治疗AD的靶点34个，同时绘制韦恩图（图1），揭示了当归可调节多个靶点发挥治疗AD的作用。

图1 当归-AD作用基因

3 药物-靶点-疾病网络

运用Cytoscape软件对当归有效活性成分及其治疗AD作用靶点进行关系网络图绘制，经分析，当归发挥重要作用的生物活性成分与对应作用靶点的相互关系见图2。不同颜色及形状代表不同的物质，其中红色代表AD，蓝色代表当归，绿色代表药物主要有效成分，黄色代表作用靶点，而边则代表成分与靶点的关系。不同的靶点可对应同活性成分，相靶点也可对不同的活性成分，揭示了当归治疗AD具有多成分、多靶点的特点。

图2 当归治疗AD的药物-靶点-疾病网络

4 当归治疗AD的靶点

登陆STRING库，导入当归治疗AD的靶点，将筛选条件设定为＞0.9，将游离网络图外的蛋白予隐藏，得到PPI网络（见图3）。该图，节点共38个，平均值4.518，图中的“节点”代表药物靶点，“边”表示靶点之间的相互作用关系。边数越多表示该节点对应的靶点在网络中的作用越重要。运用R软件，得到关键靶点的信息条形图（见图4）。结果揭示了，ADRA2A、CASP3、MAOA、JUN、SLC6A4、ADRA1A、CHRM2等蛋白的度值较高，说明这些蛋白在网络中的作用显著，是和其他蛋白互通的纽带。

图3 关键靶点PPI网络

图4 关键靶点信息

5 GO注释功能及KEGG通路分析

R软件为生物信息常用软件之一，使用前安装Bioconductor包。GO、KEGG库进行通路分析。GO通路揭示：当归治疗AD的关键靶点富集显著的前10个生物学功能主要为表明当归G蛋白偶联胺受体活性（8个靶点），突触后神经递质受体活性（7个靶点），神经递质受体活性（7个靶点），跨膜转运蛋白活性（6个靶点），G蛋白偶联神经递质受体活性（5个靶点），乙酰胆碱受体活性（5个靶点），蛋白质异二聚活性（5个靶点），金属离子跨膜转运蛋白活性（5个靶点）。药物主要有效成分可通过多靶点调控而发挥治疗AD的作用（图5）。KEGG通路分析，获得15条通路，P值＜0.01为筛选条件，获取3条主要信号通路。设置P值和相关基因的数量为筛选条件，见表2。富集分析发现，基因显著富集在（AGE/RAGE、Ca2+、p53）等通路上。

图5 关键靶点基因生物功能注释信息

讨 论

AD的发病机制与抗炎、机体代谢和免疫系统等有一定关联[17]。有人研究发现[18]神经元细胞内钙的损伤，可致AD发展，主要是神经细胞内钙信号是一个关键的调节因子，Ca2+的神经元缺失可加速记忆机体衰退，增加淀粉样变和tau病变，同时Ca2+超载可促进超氧化物的产生、代谢紊乱和细胞凋亡而促进AD的进展神经细胞死亡，这些结果提供了钙失调和AD的代谢功能障碍假说，Ca2+信号通路上有AD的潜在治疗靶点。Ca2+的调节对神经细胞的正常生长至关重要，钙离子稳态失调是致许多神经退行性疾病的重要因素，包括AD，在AD的大脑中，其他类型的细胞也被破坏了Ca2+通道和腔室参与了可能成为潜在靶点的疾病机制[19]。

p53可补偿或防御机制的基础防止神经元退化，具体包括维持氧化还原稳态，调节炎症，控制突触功能，减少淀粉样蛋白β肽和抑制神经元细胞周期的重新进入，因此，p53依赖性代偿机制的失调可能导致神经元功能障碍导致神经退行性变[20]。AD大脑中，核外和p53介导的DNA损伤反应明显减少，控制大脑呈现健康的DNA损伤反应，提示AD核p53功能的丧失可能与p53有关聚集和/或与tau低聚物的相互作用。鉴于p53在细胞生理学中的重要作用这一关键转录因子的破坏可能导致AD患者神经退行性变的不可逆转过程[21]。

有人研究发现[22]，对于1424个DEGs（620个基因表达上调，804个基因表达上调）AD组与正常对照组间差异有显著性（P＜0.05）。功能性注释结果显示，神经活性配体-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、雌激素信号通路和notch信号通路比较四种活性成分的靶基因，共发现16个共有基因。其中HTR2A和ADRA2A也在神经活性配体-受体相互作用途径中富集。海马神经元的丢失是一个早期AD的形态学症状，我们发现在脑缺血模型中，海马CA3区锥体神经元的死亡AD的发生依赖于BECN1和CASP3基因的过度表达脑缺血后早期。我们的观察结果表明脑损伤的关键作用缺血再灌注在AD发展中的作用通过原发性海马神经变性，包括CA3区随着认知功能的逐渐退化以及延长生存期。因此，损害上述区域导致了环境恶化短期记忆，导致无法创造新的记忆，脑缺血再灌注损伤的共同遗传机制研究促进对这两种疾病的新病理途径的了解，并指导今后的研究脑缺血或AD研究的新方向[23]。

综上，本研究运用网络药理学研究当归治疗AD相关作用机制，研究作用机制初步筛选当归有效成分治疗AD的作用机制，揭示其临床治疗过程涉及了多个有效活性成分、作用靶标及多个信号通路，其作用机制十分复杂，并非仅通过单个成分、作用单个靶标或调控单条通路发挥作用，与中药治疗疾病的多靶点特点相吻合。为进一步从当归药中提取有效活性成分治疗AD提供了参考依据。但仅从网络药理学层面来探究当归药物有效活性成分治疗AD的作用机制，只是一种理论的预测探讨，仍需通过相关实验来进一步验证当归作用的具体机制，为临床应用提供支撑。