太子参-牡丹皮药对治疗糖尿病心肌病网络药理学机制探讨

张文婷，徐瑾，王时光

1 安徽中医药大学第一临床医学院 安徽合肥 230012

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

1974 年，Hamby等人首先对糖尿病心肌病给了明确的定义，认为在糖尿病患者中出现的一种特异性心肌病，表现为心肌结构和功能重构，其发病过程不取决于冠状动脉疾病、高血压病、瓣膜病或其他心肌病变，而是以心肌肥大、纤维化和低心肌收缩力的小血管病变等病理变化为主，最后进展为慢性心力衰竭[1]。糖尿病心肌病发生机理复杂，目前尚缺乏特异性的诊断手段。传统的药物疗法包括了血糖调节和改善心功能。在中医上，糖尿病心肌病被称作“消渴病心病”，其主要原因是消渴病没有得到及时的治疗，导致其进一步发展和演变。消渴病的根本病机在于肺肾阴虚燥热，如果没有得到及时的治疗，则会不断耗气伤阴，进而会影响到心脏，导致心脉瘀阻，从而导致心衰。益气养阴、活血化瘀是中医药治疗糖尿病及其并发症的主要治则，因此治疗消渴的首选治疗思路以益气养阴活血通络思想指导进行组方，可控制糖尿病及其并发症的进一步发展。基于此理论依据，丹蛭降糖胶囊选择太子参、生地黄、牡丹皮、菟丝子、泽泻、水蛭组成新安验方。

太子参-牡丹皮药对出自丹蛭降糖胶囊，既往试验验证其对于糖尿病心肌损伤有显著的疗效[2]。太子参始是《本草从新》中记载的一种具有益气健脾，生津润肺功效的中药。太子参具有降糖调脂、心肌保护、免疫调节、抗氧化、抗应激、 抗疲劳、抗肿瘤等现代药理作用[3]。牡丹皮是《神农本草经》中记载的一种具有清热凉血，活血化瘀，散瘀消痈功效的中药，牡丹皮具有消炎解热、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗肿瘤等现代药理学作用[4]。本研究基于药物和疾病的药理学网络，试从分子水平上探讨太子参-牡丹皮药对治疗糖尿病心肌病的作用机制，为中医药防治糖尿病心肌损伤提供理论依据。

材料与方法

1 太子参-牡丹皮药对活性成分的获取及靶点预测

获取太子参-牡丹皮药对的活性成分及靶点预测，首先通过中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库选条件设定为口服药物生物利用度（OB）≥15%，类药性（DL）≥0.15，筛选出太子参和牡丹皮的活性成分。将筛选出的各个活性成分在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）网站中找出对应Canonical SMILES结构。并将各个结构输入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）数据库中，设置species为“Homo sapiens”，设定 probability＞0筛选出符合条件的各活效成分的作用靶点。得到各个活性成分作用的全部靶点。

2 糖尿病心肌病相关靶点的获取

通过搜索“Diabetic Cardiomyopathies”这一关键字，在Disgenet数据库（https：//disgenet.org）和GeneCards数据库（https：//genecards.org）中搜索出对应的靶点基因，同时在GeneCards数据库中得到糖尿病心肌病的候选靶点，选取评分（表示 DCM与靶点基因之间的关联程度）大于等于5的靶点为 DCM的候选靶点。取两数据库中靶点进行整合，删除重复靶点，构建糖尿病心肌病靶点数据库。

3 构建药物-活性成分-靶点网络图

利用Cytoscape 3.9.0软件构建药物-活性成分-靶点网络图，并对网络图进行分析。其中在该网络图中节点代表太子参、牡丹皮、活性成分、靶点等；边代表上述节点之间的相互关系。

4 构建蛋白互作（PPI）网络图

运用Venny图获取疾病与中药的交集靶点。在此基础上，利用STRING 11.5平台（https：// cn.stringdb.org）对二者的交集靶点进行拓扑分析，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。并通过Cytoscape 3.9.0软件对于蛋白质-蛋白质相互作用网络图进一步优化，利用内部插件Cytohubba筛选出核心靶点，并构建核心靶点网络图。

5 富集分析与通路分析

在Metascape数据库（https：//cn.metascape.org）中选定物种为人，设置Min Overlap＝3，P Value Cutoff＝0.01，Min Enrichment＝1.5为筛选条件，将疾病与中药的交集靶点基因输入数据库中，对上述靶点基因选择生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）、分子功能（molecular function）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）上述四个部分进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和通路分析。GO分析结果以柱状图进行展示，KEGG结果以气泡图的形式进行展示。

结 果

1 太子参-牡丹皮药对活性成分的获取及靶点预测

通过TCMSP数据库的筛选，筛选出8个太子参活性成分，11个牡丹皮活性成分，共得到19个活性成分，见表1。通过Swiss Target Prediction数据库筛选出太子参8个活性成分共435个靶点，牡丹皮11个活性成分中有7个活性成分在Swiss Target Prediction中预测到靶点，包括槲皮素（quercetin）、5-[亚甲基]巴比妥酸（5-[[5-（4-methoxyphenyl）-2-furyl]methylene]barbituric acid）、苯甲酰芍药苷（benzoyl paeoniflorin）、堪非醇（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）、丁子香萜（Mairin）、芍药苷（paeoniflorin_qt），共381个靶点。两中药共预测到了815个靶点，通过去除重复项后得到277个靶点。

表1 太子参-牡丹皮药对活性成分

2 糖尿病心肌病关键靶点的筛选

在Disgenet数据库中查到与糖尿病心肌病相关的靶点共220个，在GeneCards数据库中查到与糖尿病心肌病相关的靶点共5977个，选择打分值≥5 的2334个靶点作为糖尿病心肌病候选靶点，将两数据库中的靶点进行合并，通过去除相同靶点后共得到2424个靶点。将靶点与太子参-牡丹皮药对活性成分的277个靶点绘制成韦恩图，见图1，将该共有的靶点与太子参-牡丹皮药对活性成分的靶点进行匹配映射，得到共同靶点109个。也就是太子参-牡丹皮药对主要以作用上述关键靶点为主，起到预防和治疗糖尿病心肌损伤作用。

图1 药物与疾病的韦恩图

3 构建药物-活性成分-靶点网络图

将中药、活性成分以及靶点导入Cytoscape软件，进行药理学网络图的构建，见图2。其中根据各节点的度值，设置各节点的面积大小，度值越大，各节点的面积越大，表明活性成分与靶点作用越大，说明二者之间联系越大，在发挥防治糖尿病心肌损伤的作用贡献越大。该网络中山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）的度值排名靠前，说明这些有效成分在治疗糖尿病心肌病的潜在靶点更多。

图2 药物-活性成分-靶点网络图

4 构建蛋白互作（PPI）网络图

将疾病与中药的交集靶点导入STRING 11.5平台进行拓扑分析，筛选出关键靶点，通过Cytoscape对网络图进行优化分析，见图3。并利用其内部插件Cytohubba，根据度值筛选出前20个核心靶点，分别为肿瘤坏死因子（TNF）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、肿瘤抑制蛋白（TP53）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）、天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、雌激素受体1（ESR1）、热休克蛋白90α家族A类成员 1（HSP90AA1）、过氧化物合酶2（PTGS2）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、沉默信息调节因子1（SIRT1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、 过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPARA）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、激酶插入区受体（KDR）、糖原合成酶激酶3B（GSK3B），对前20个核心靶点再次进行网络图构建，见图4。

图3 蛋白互作网络图

图4 前20核心靶点

5 GO分析与KEGG分析

通过Metascape数据库将药对与疾病的共同靶点进行富集和通路分析，根据条件筛选出的结果中选择前10个生物过程包括磷酸化的正向调节、蛋白质磷酸化的正向调节、激酶活性的调节、激酶活性的正向调节等。前10个细胞组成包括膜筏、膜微结构域、胞膜、质膜筏等。前10个分子功能包括核受体活性、配体激活的转录因子活性、类固醇结合、转录因子结合等。选择前20个信号通路，这些通路包括癌症通路（Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Rap1 signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。将GO分析结果以柱状图形式展示，见图5。通过KEGG分析选择前20个富集结果较强的信号通路，其中纵坐标表示通路名称，横坐标代表基因比率。通路中富集的基因数目以圆圈的大小表示，基因数目越多圆圈越大。圆圈颜色的深浅代表Pvalue，其中颜色越深代表可信度越高，见图6。

图5 GO分析柱状图

图6 KEGG气泡图

讨 论

糖尿病心肌病在中医上被称为“消渴病心病”“心悸”“怔忡”等。主要由于糖尿病久治不愈，逐渐影响及心，病机演变主要为阴虚燥热逐渐耗气伤阴，导致痰瘀互结最终进展为阴阳两虚。主要有4个重要致病因素包括虚、痰、瘀、水[5]。运用网络药理学方法发现太子参和牡丹皮通过多种活性成分、多个靶点和多条通路来发挥防治糖尿病心肌病的作用。

通过对药物-活性成分-靶点网络图的分析可知网络中的重要节点为山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）。山奈酚是一种天然黄酮类化合物，可上调 SIRT1，抑制NF-κB 核转位，并激活核因子E2相关因子（Nrf2），从而抑制糖尿病引起的心肌炎症和氧化应激[6]。并可通过抑制 ASK1/MAPK 及AGE-RAGE/MAPK 信号通路，发挥保护糖尿病心肌病作用[7]。槲皮素是一种天然类黄酮，存在于多种植物中。槲皮素可以通过Nrf2通路抑制高糖诱导的细胞焦亡小体激活和线粒体损伤，从而改善糖尿病心肌细胞损伤[8]。槲皮素可对糖尿病大鼠心肌细胞中caspase 9和3的激活减少，防止过度凋亡[9]。通过减少糖尿病心肌病小鼠模型中的炎症反应和甘油磷脂代谢失调来改善心脏损伤[10]。刺槐素是一种天然黄酮类化合物，在多种心血管疾病中是一种抗氧化剂和抗炎剂。在链脲佐菌素诱导的糖尿病心肌病大鼠模型中，通过PPAR-α/AMPK信号通路，对抗高葡萄糖诱导的Bax和 IL-6增加和Bcl-2的减少。表明通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡发挥心脏保护作用[11]。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，通过抑制NF-kB介导的炎症和激活Nrf2介导的抗氧化反应来预防糖尿病性心肌病，还可以预防STZ 诱导的糖尿病小鼠的心脏纤维化、肥大和功能障碍[12]。此外通过上调磷酸化蛋白AMPK和AKT/GSK-3通路，同时降低蛋白酶体活性，从而预防小鼠糖尿病心肌病[13]。还可以抑制JNK调节的miR-22并阻断自噬[14]。

通过蛋白互作网络图分析可得TNF、AKT1、SRC、TP53等靶点在作用过程中发挥主要作用。 TNF与糖尿病心肌病的发生发展有紧密联系，TNF- α在糖尿病患者中过度表达。过量的TNF- α可介导免疫反应，诱导细胞凋亡，抑制心肌收缩，参与心肌重构。TNF-α转基因小鼠的过度表达导致心脏增大、心脏功能障碍和心肌纤维化[15]。Akt在调节心血管功能（如心脏生长、心肌收缩功能和冠状血管生成）方面具有明确的作用。PI3K-Akt-FoxO3a 通路可以预防STZ诱导的糖尿病大鼠心功能恶化和结构性心肌病，并减少糖尿病心肌细胞的凋亡。AKT-Foxo1磷酸化水平的降低与DCM胰岛素抵抗和细胞凋亡的发生密切相关，在抑制细胞凋亡、改善DCM心功能方面具有重要作用[16]。 在糖尿病心肌病中Akt通路的激活为细胞提供了生存信号，通路激活后显着降低心肌细胞凋亡和心肌损伤[17]。SRC它参与心脏肥大的多种信号通路，如G蛋白偶联受体信号转导。一些研究人员报告称，c-Src在糖尿病相关心血管疾病的病理生理学中发挥着重要作用[18]。TP53在糖尿病心肌病中诱导糖酵解和凋亡调节因子 （TIGAR），TIGAR在糖尿病心肌病小鼠中提高HG诱导的ROS和细胞凋亡水平[19]。

通过KEGG富集分析，太子参-牡丹皮药对可直接干预癌症、MAPK、PI3K-Akt等信号通路。丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号通路有效地参与了DCM的发病机制。AMPK 的激活对糖尿病病症中的缺血性损伤、心脏肥大和心脏细胞凋亡具有许多心脏保护作用。p38作为MAPK的成员，已知被激活并参与心脏肥大、心肌纤维化和细胞凋亡 。靶向p38MAPK是控制DCM心脏细胞凋亡的另一种治疗策略[20]。Akt发挥保护细胞，可以通过抑制多个靶点的有关细胞凋亡信号通路。研究显示，心肌细胞的生长、代谢和凋亡，与PI3K/Akt信号通路密切相关。并可以通过PIK3CA对心脏起到保护作用[21]。Sirt1位于PI3K-Akt的上游，激活Sirt1-Fox1、PI3K-Akt等信号通路可抑制心肌细胞OS和细胞凋亡，从而达到缓解和治疗DCM的目的[22]。PI3K/Akt有3 种激活途径，包括胰岛素、GSK-3和 哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR） 。阻断糖尿病大鼠的PI3K/Akt通路可显着降低调节细胞凋亡的eNOS和mTOR蛋白的表达。PI3K/AKT/mTOR通路参与调节内质网应激 （ERS） 诱导的细胞死亡[23]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法从分子水平探讨太子参-牡丹皮药对对治疗糖尿病心肌病的机制，太子参-牡丹皮药能通过多种活性成分、多靶点、多途径对糖尿病心肌病起到保护作用，为糖尿病心肌病的未来防治提供新思路。